1、抗體的制備與純化,第一節(jié) 常規(guī)抗血清的制備方法,一、動(dòng)物的免疫 二、抗血清的采集,1、免疫動(dòng)物的選擇 2、抗原接種 3、佐劑的應(yīng)用,動(dòng)物的免疫,免疫動(dòng)物的選擇,種屬與品系 經(jīng)濟(jì)性 “R”型與“H”型 經(jīng)驗(yàn)性適配,抗原接種,劑量： 注射途徑： 間隔與免疫時(shí)間： 接種次數(shù)：,佐劑的概念與種類,概念：與抗原同時(shí)或先于抗原進(jìn)入 機(jī)體，以提高抗原的免疫原 性的物質(zhì)。 種類：非免疫原性物質(zhì) 免疫原性物質(zhì),佐劑的作用機(jī)理,延長抗原的作用時(shí)間 增強(qiáng)吞噬作用 刺激抗原提呈 促進(jìn)細(xì)胞因子分泌 誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞分裂、增殖 影響T細(xì)胞“極化”,1、采集方法 2、血清的分離與滅活,抗血清的采集,采集方法,一次性采集 多次性

2、采集,抗血清的分離與滅活,血清析出的溫度 血清的滅活,第二節(jié) 單克隆抗體的制備方法,一、單克隆抗體與雜交瘤技術(shù) 二、單克隆抗體的制備過程 三、單克隆抗體的特性,單克隆抗體與雜交瘤技術(shù),1、單克隆抗體 2、雜交瘤技術(shù),表位A,表位B,表位C,抗原,克隆A,克隆B,克隆C,單克隆抗體,由一個(gè)識別單一抗原決定簇（表位）的B細(xì)胞克隆所產(chǎn)生的同源抗體。,雜交瘤技術(shù),通過融合經(jīng)免疫的小鼠脾細(xì)胞和建系小鼠骨髓瘤細(xì)胞，以獲得同時(shí)具有抗體分泌功能和保持細(xì)胞永生性特征的雜交瘤細(xì)胞克隆。是獲取單克隆抗體的主要技術(shù)途徑。,單克隆抗體制備過程,1、致敏淋巴細(xì)胞的準(zhǔn)備 2、骨髓瘤細(xì)胞的準(zhǔn)備 3、細(xì)胞融合 4、選擇性培養(yǎng)

3、5、抗體分泌細(xì)胞的篩選 6、克隆化過程 7、單克隆抗體的制取,抗原,致敏淋巴細(xì)胞,骨髓瘤 細(xì)胞,融合,選擇性 培養(yǎng),抗體分泌細(xì)胞篩選,克隆化,單抗制取,單抗純化,單抗鑒定,致敏淋巴細(xì)胞的準(zhǔn)備,動(dòng)物選擇：品系、年齡、性別、健康狀態(tài) 抗原接種：方式體內(nèi)、體外 劑量0.5-100g 次數(shù)視抗原而定 間隔視抗原而定 佐劑視抗原而定 收集時(shí)間：末次接種后72h,骨髓瘤細(xì)胞的準(zhǔn)備,細(xì)胞株處于良好的生長狀態(tài) 細(xì)胞株保持HGPRT缺陷狀態(tài),細(xì)胞融合,方式：物理、化學(xué)、生物 PEG融合要點(diǎn)：（見圖）,致敏淋巴細(xì)胞,骨髓瘤細(xì)胞,離心 1000rpm 10min,50%PEG 1ml,培養(yǎng)液 10ml,離心 100

4、0rpm 7min,37。C搖動(dòng)、由慢漸快1min、靜止1.5min,加入HAT培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，置于培養(yǎng)孔內(nèi),選擇性培養(yǎng),隨機(jī)融合后的細(xì)胞類型 HAT選擇培養(yǎng)原理,隨機(jī)融合后的細(xì)胞類型,細(xì)胞組合 HGPRT 生長狀態(tài) 淋巴細(xì)胞 + 骨髓瘤 + 長期生長 淋巴細(xì)胞 + 淋巴細(xì)胞 + 短期生長 骨髓瘤 + 骨髓瘤 不能生長 未融合淋巴細(xì)胞 + 短期生長 未融合骨髓瘤 不能生長,HAT選擇培養(yǎng)原理,核苷酸從頭合成途徑（de novo synthesis）,核苷酸補(bǔ)救合成途徑（salvage synthesis）,核苷酸,DNA,氨基碟呤（A）,次黃嘌呤（H）,胸腺嘧啶核苷（T）,抗體分泌細(xì)胞的篩選,

5、對篩選方法的要求： 多大量樣品一次檢測 快迅速取得檢測結(jié)果 準(zhǔn)檢測結(jié)果可靠性高 靈檢測方法靈敏度高 常用篩選方法： ELISA、RIA、CDC、IFA等,克隆化過程,概念：建立單一細(xì)胞克隆 方法：有限稀釋法 克隆建立的標(biāo)準(zhǔn)：連續(xù)兩次以上100%陽性孔 飼養(yǎng)細(xì)胞：同品系小鼠腹腔、胸腺、脾細(xì)胞,有限稀釋法,計(jì)數(shù),103/ml,102/ml,10/ml,0.5-2/孔,單克隆抗體的制取,制取方式： 體外培養(yǎng)罐法 體內(nèi)腹腔接種 純化： 鹽析、層析、制備型HPLC 鑒定： 特征鑒定Ig類型、親和力、效價(jià)、特異性 決定簇鑒定是否針對同一決定簇,多抗與單抗制劑的比較,多抗 單抗 單抗 （血清） （腹水） （

6、培養(yǎng)上清） 特異性抗體含量（mg/ml） 0.1-1 0.5-5 0.005-0.025 無關(guān)Ig含量（mg/ml） 10 0.5-1 其他血清蛋白 大量 極少 均一性 + + 特異性 多決定簇 單決定簇 單決定簇 穩(wěn)定性 較好 略差 略差 重復(fù)性 差 好 好,單克隆抗體的特性,1、理化性狀高度均一 2、抗原結(jié)合性高度特異 3、生物活性高度單一,第三節(jié) 抗體的純化與鑒定,一、抗體純化的目的與方法 二、純化抗體的鑒定與保存,抗體純化的目的,1、去除雜蛋白 2、去除雜抗體 3、去除非同類抗體,抗體純化的方法,1、鹽析、層析技術(shù) 2、抗原吸附,純化抗體的鑒定,1、多克隆抗體的鑒定 2、單克隆抗體的鑒定,純化抗體的保存,1、4。C保存 2、 20。C保存 3、冷凍干燥保存,本章小結(jié),1、多克隆抗體的制備 2、雜交瘤技術(shù)的原理與應(yīng)用 3、單克隆抗