1、動物實驗研究方法及其在中醫(yī)研究中的應(yīng)用,1,PPT學(xué)習(xí)交流,大家上過“實驗動物學(xué)”沒有？ 動物實驗是近代生命科學(xué)實驗發(fā)展起來的重要手段，生命科學(xué)的許多重大發(fā)現(xiàn)和突破均建立在動物實驗之上。,2,PPT學(xué)習(xí)交流,美國心理學(xué)會動物研究指導(dǎo)總則“動物行為研究者應(yīng)努力促進對基本行為原理的理解和/或為提高人類的健康和幸福作貢獻。為達到這些目標，研究者要保證動物的權(quán)利和人道地對待它們。雖然有法律和規(guī)定，但一只動物的即時保護則有賴于科學(xué)家的個人良知?！保˙.H.坎特威茨等. 實驗心理學(xué), 116） 美國心理學(xué)會還提供了學(xué)生研究者的指導(dǎo)原則?？傮w上，“當(dāng)采用動物被試時，應(yīng)精心照料并盡可能減少它們的痛苦和不適。”

2、 （B.H.坎特威茨等. 實驗心理學(xué), 124）,3,PPT學(xué)習(xí)交流,中醫(yī)能不能采用實驗動物？突出的問題是四診困難、情志難以把握，大家有什么看法。有利的因素、不利的因素分別有哪些？ 有人懷疑心理學(xué)研究的價值，責(zé)問政府何以資助小白鼠走迷津。這是他們對于心理學(xué)研究的期望不恰當(dāng)，而不在于心理學(xué)研究的本身。（B.H.坎特威茨等. 實驗心理學(xué), 24） 有人通過幾年的研究發(fā)現(xiàn)，盡管不同地區(qū)山雀的“方言”不同，但在同一地區(qū)生活的山雀所發(fā)出的入侵警報模式確可以穩(wěn)定地延續(xù)幾代。（B.H.坎特威茨等. 實驗心理學(xué), 35） 雄獅實驗。,4,PPT學(xué)習(xí)交流,動物實驗的重要性（教材第二段）： 動物實驗是實驗中醫(yī)學(xué)的

3、重要組成部分和重要的研究方法和手段，無論對中醫(yī)學(xué)數(shù)千年來所積累的疾病認識、防治豐富經(jīng)驗進行驗證和總結(jié)，對歷代醫(yī)家理法方藥的研究，對中醫(yī)學(xué)理論的研究和發(fā)展，還是對當(dāng)前中醫(yī)藥學(xué)各個學(xué)科的教學(xué)、科研，對新的治療方法（包括應(yīng)用藥物和非藥物療法）的發(fā)展，乃至對新的中醫(yī)藥學(xué)理論體系的創(chuàng)立，等等，都是不可缺少的。,5,PPT學(xué)習(xí)交流,近幾十年來，實驗動物學(xué)已經(jīng)作為一門獨立的學(xué)科迅速地發(fā)展起來。實驗動物學(xué)對實驗動物的飼養(yǎng)、繁殖、馴化、監(jiān)測和開發(fā)應(yīng)用，以及動物實驗的規(guī)范和要求形成了一整套完整的理論和方法，這些同樣適用于中醫(yī)動物實驗。同時，中醫(yī)的動物實驗又有其自身特點，其研究、發(fā)展還將豐富實驗動物學(xué)的內(nèi)容。,第一

4、節(jié) 動物實驗的主要要求和特點,6,PPT學(xué)習(xí)交流,一、實驗動物的選擇 實驗動物的定義：實驗動物是指以實驗研究為目的，在一定的環(huán)境條件控制下，經(jīng)過培養(yǎng)馴化，具有明確的生物學(xué)特性和清楚的遺傳和微生物背景的動物。,7,PPT學(xué)習(xí)交流,圖1 小鼠 圖2 裸小鼠 圖4 裸大鼠 圖5 大鼠 圖6 白兔 圖7 兔的飼養(yǎng),圖8 比格犬及其飼養(yǎng) 圖9 馬及其飼養(yǎng),常用實驗動物,8,PPT學(xué)習(xí)交流,實驗動物種類繁多，在進行實驗時，應(yīng)根據(jù)課題的需要和動物的特性加以選擇，使研究目的與動物的種屬、特性和個體差異相吻合，才能保證研究工作的順利進行。 不同的科學(xué)實驗要求選擇和開發(fā)最適宜的實驗動物。正確選擇實驗動物，實驗設(shè)計

5、周密詳盡，可以節(jié)省人力、動物和時間，以最小的代價，最大限度地獲得可靠的研究結(jié)果。否則，不僅會造成不必要的浪費，嚴重的還會影響到實驗結(jié)果的判斷，甚至導(dǎo)致實驗的失敗。因此，選擇和開發(fā)實驗動物是動物實驗的首要環(huán)節(jié)，至關(guān)重要，應(yīng)予以足夠的重視。 在醫(yī)學(xué)研究中首先要從研究目的和實驗要求來選擇實驗動物，其次要考慮是否容易獲得、是否經(jīng)濟及容易飼養(yǎng)等因素。,9,PPT學(xué)習(xí)交流,三個基本要求：實驗動物通常應(yīng)該具備個體間的均一性、遺傳性能的穩(wěn)定性和比較容易獲得這三個基本要求。 具體要求如下： 1盡量選用機能、代謝、結(jié)構(gòu)及其它方面機能與人相似的實驗動物 一般來說，動物的進化階段愈高，機能、代謝、結(jié)構(gòu)愈復(fù)雜，也就愈接

6、近人類。 2選用標準化的實驗動物 標準化實驗動物指遺傳背景明確、飼養(yǎng)環(huán)境與動物體內(nèi)的微生物得到控制、符合一定標準的實驗動物。,10,PPT學(xué)習(xí)交流,只有選用標準化實驗動物，而且實驗過程也在標準環(huán)境中飼養(yǎng)的動物，在實驗中才能排除因動物雜交、遺傳上的不均質(zhì)及環(huán)境條件的變化，所引起的個體反應(yīng)不一致，排除因動物攜帶細菌、病毒、寄生蟲和潛在疾病的影響，才能便于分析實驗結(jié)果，減少實驗誤差，提高科學(xué)性，準確性，把所獲得的結(jié)果與同類研究進行比較、交流，并得到承認。在實驗研究中應(yīng)避免使用隨意交配繁殖的動物，而應(yīng)根據(jù)研究目的選擇用遺傳學(xué)控制的方法培育出來的近交系、突變系、系統(tǒng)雜交或封閉群動物。同時應(yīng)對實驗動物進行

7、微生物控制，發(fā)展使用無菌動物、已知菌動物或無特定病原體（SPF）動物。,11,PPT學(xué)習(xí)交流,實驗動物的分類 按遺傳控制分類： （1）近交系，即純系動物：其動物遺傳的均質(zhì)性保證了實驗反應(yīng)的穩(wěn)定性。 （2）封閉群動物：能較好地代表自然群體的遺傳特性。 （3）雜交一代動物（F1）：在一定程度上，兼有近交系和封閉群的特點。 （4）突變動物：往往具有鮮明的人類疾病模型特征。,12,PPT學(xué)習(xí)交流,按微生物控制的程度，我國將實驗動物分為四個等級： （1）普通級動物：一般為教學(xué)示范用。 （2）清潔級動物：國內(nèi)科研工作要求的標準動物，適合于大多數(shù)科研課題。 （3）無特定病原體動物（SPF動物）：國際標準實驗

8、動物。 （4）無菌動物（CF動物）和悉生動物：僅在特殊課題需要時使用。,13,PPT學(xué)習(xí)交流,圖10 動物實驗中心 圖11 清潔級準備室,圖12 清潔級走廊 圖13 小鼠飼養(yǎng)室,14,PPT學(xué)習(xí)交流,3選用解剖、生理特點符合實驗?zāi)康囊蟮膶嶒瀯游?催吐實驗適宜選用猴、貓，不選用大小鼠，因為小/大鼠無嘔吐反應(yīng)。 膽囊功能實驗不選用大鼠，因為大鼠無膽囊。 發(fā)汗中藥的研究不能選用小鼠（無汗腺）。 慢性支氣管炎的實驗不能選用大小鼠，因為小/大鼠氣管及支氣管腺不發(fā)達。 計劃生育研究常選用小鼠和大鼠。因繁殖力強，性周期和妊娠期短，生長快。如常用小鼠做抗生育、抗著床、抗早孕、抗排卵等實驗應(yīng)用上的首選動物。,

9、15,PPT學(xué)習(xí)交流,心血管病研究豬(辛克萊小型豬/廣西巴馬小型豬/歐米尼豬)。豬冠狀動脈，在解剖學(xué)、血液動力學(xué)上與人類相似。對高膽固醇食物的反應(yīng)與人一樣，很容易出現(xiàn)動脈粥樣硬化的典型病灶。 實驗外科學(xué)研究犬(比格犬/華北犬/西北犬/狼犬)。內(nèi)臟與人相似，比例近似。臨床醫(yī)生在研究新的手術(shù)或麻醉方法時往往選用犬來做動物實驗，取得經(jīng)驗和技巧后用于臨床。如心血管外科，腦外科，斷肢再植， 器官和組織移植等。 行為學(xué)和精神病及神經(jīng)生物學(xué)研究獼猴。 制造和鑒定脊髓灰質(zhì)炎疫苗獼猴是唯一的實驗動物。,16,PPT學(xué)習(xí)交流,4選用不同種屬品系實驗動物某些特殊反應(yīng)，使適合于不同研究目的的需要 腫瘤研究常選用近交系

10、小鼠，如AKR小鼠白血病 發(fā)生率可達90；C3H小鼠乳腺癌發(fā)病率達97，而不選用C57BL等小鼠，因其乳腺癌發(fā)病率極低(5)。 發(fā)熱、解熱和檢查致熱源實驗適宜選用兔做實驗，因?qū)俸銣貏游?，對致熱物質(zhì)反應(yīng)敏感。 高血壓病研究選用SHR大鼠，因自發(fā)性高血壓，心血管疾病發(fā)病率高，對降壓藥物有反應(yīng)。 耳科學(xué)研究豚鼠聽神經(jīng)對聲波特別是7002000Hz的純音最敏感，常用于聽覺和內(nèi)耳疾病的研究。 免疫學(xué)研究豚鼠易引起變態(tài)反應(yīng)，產(chǎn)生大量補體，是過敏性休克和變態(tài)反應(yīng)研究的首選動物。,17,PPT學(xué)習(xí)交流,5實驗動物種屬、品系的選擇 如果實驗結(jié)論只針對某一品系則使用一個品系。 如果實驗結(jié)論針對整個物種在內(nèi)的一般性

11、研究則使用多個不同來源的品種、品系。 一般對多物種進行實驗時，應(yīng)先選小型動物，再推廣到大型物種；要求只能建立在對多個物種進行實驗的基礎(chǔ)上，才能推廣到人類，也稱動物實驗外推。常用順序時小鼠、大鼠、兔、犬、猴。,18,PPT學(xué)習(xí)交流,6遵守動物實驗的一般規(guī)則 （1）年齡、體重 應(yīng)根據(jù)實驗?zāi)康膩磉x擇適齡動物。一般實驗均用成年動物進行；幼齡動物一般較成年動物敏感；老年動物的代謝活動及各種機能低下，反應(yīng)遲鈍，除了作老年醫(yī)學(xué)研究外，其它專業(yè)很少應(yīng)用。同一實驗所選動物年齡應(yīng)一致，體重大致相近，一般不應(yīng)相差10%。,19,PPT學(xué)習(xí)交流,（2）性別 不同性別動物對同一實驗處理（如藥物、刺激等）的感受性常有差異

12、，在實驗研究中如無特殊要求，一般宜選用雌雄各半做實驗。 （3）生理狀態(tài)與健康情況 動物的不同生理狀態(tài)如懷孕、授乳時對外界刺激的反應(yīng)常有所改變，在一般研究中應(yīng)從實驗組中刪除；必須選用健康動物進行實驗。 （4）實驗季節(jié)和晝夜過程 不同季節(jié)和不同晝夜，動物機體反應(yīng)性會有一定改變，在實驗動物選擇中也應(yīng)予以注意。,20,PPT學(xué)習(xí)交流,（5）實驗的重復(fù)與肯定 由于不同種動物有不同的功能和代謝特點，所以在肯定一個實驗結(jié)果時，往往采用兩種以上動物進行比較觀察，尤其將動物實驗結(jié)果推斷到人的實驗時應(yīng)該慎重。例如，所選的實驗動物如一種為嚙齒類動物，另一種應(yīng)該為非嚙齒類動物。常用的序列是小鼠、大鼠、狗或猴。 二、中

13、醫(yī)動物實驗研究的注意點 實驗動物在中醫(yī)實驗的應(yīng)用和發(fā)展中，建議注意以下幾個方面。 1中醫(yī)動物實驗研究應(yīng)以中醫(yī)理論為指導(dǎo) 2中醫(yī)動物實驗研究應(yīng)從中醫(yī)臨床出發(fā) 3中醫(yī)動物實驗研究應(yīng)突出中醫(yī)治療原則,21,PPT學(xué)習(xí)交流,一、證動物模型的開創(chuàng)和發(fā)展 自本世紀60年代以來，在中醫(yī)證的動物模型制作與研究方面做了大量的研究工作。迄今證的動物模型逾150多種。其中包括各種虛證（陰虛、陽虛、氣虛、血虛、各臟腑虛）、血瘀證、肝郁證、寒證、熱證、溫病衛(wèi)氣營血諸證、里實證等模型，等等。實驗動物疾病模型應(yīng)用于中醫(yī)臨床研究，為中醫(yī)診療方法研究提供了大量的實驗?zāi)Ｐ停瑸榕R床理論的深化與新理論的形成提供了便利。 教材上的事例

14、很好。,第二節(jié) 中醫(yī)動物實驗研究的主要內(nèi)容,22,PPT學(xué)習(xí)交流,二、以動物實驗驗證臨床治療方法，探求其作用機理 臨床治療方法的動物實驗研究主要包括以下幾方面（以下的例子很好，可以選擇性介紹）： 1研究經(jīng)方的作用機理（如姜廷良的桂枝湯研究） 2研究名老中醫(yī)經(jīng)驗療法的作用機理（如二仙湯的研究） 3應(yīng)用于新藥開發(fā)（如譚日強肝達康片的研制）,23,PPT學(xué)習(xí)交流,三、中醫(yī)基礎(chǔ)理論的研究及其在教學(xué)上的應(yīng)用 四、其它研究與應(yīng)用 動物實驗在中醫(yī)研究中已滲入到各個領(lǐng)域。除以上所介紹的外，較多的應(yīng)用領(lǐng)域有中藥藥理（包括性味歸經(jīng)）的實驗研究、中草藥毒理的動物實驗、各類常用中草藥有效成份的藥理、毒理和代謝，中草藥

15、原料開發(fā)、保健品和化妝品等開發(fā)，以及對其安全性評價等等。,24,PPT學(xué)習(xí)交流,從生物學(xué)觀點看，人與動物既有特殊性也有其共同，正因為人與動物存在著共同性，所以動物實驗結(jié)果對人是有參考意義的，而且實驗動物可以根據(jù)研究目的需要進行各種實驗，容許嚴格控制實驗條件，可以重復(fù)實驗，進行多指標觀察與損害性觀察。因此利用動物實驗，結(jié)合臨床觀察，已成為中醫(yī)藥研究必要手段。由于辨證為中醫(yī)的特點之一，因此動物證的研究被列為研究中醫(yī)的突破口，用動物模擬“證”的實驗研究。然而，復(fù)制中醫(yī)“證”的動物模型工作復(fù)雜、難度大、任務(wù)艱巨。盡管如此，近年來在廣大中、西醫(yī)和中西醫(yī)結(jié)合科研工作者的努力下，研制出了大量的動物模型。其復(fù)

16、制方法主要有3類：,第三節(jié) 證動物模型研究范例,25,PPT學(xué)習(xí)交流,1依據(jù)中醫(yī)基礎(chǔ)理論。 2依據(jù)西醫(yī)臨床、藥學(xué)知識。 3根據(jù)科研成果。 教材介紹了三個范例。 一、寒涼藥、溫?zé)崴幩潞C、熱證動物模型 二、乙酰苯肼致血虛證動物模型 三、風(fēng)寒濕邪家兔痹證模型 問題是，常用實驗動物，大鼠、小鼠能不能實現(xiàn)四診，能不能實現(xiàn)基于四診的辨證，以及辨證論治？,26,PPT學(xué)習(xí)交流,小鼠辨證論治方法的由來和進展 方肇勤 潘志強 陳曉 盧文麗 付曉伶 李海燕 陳德溯 侯俐 廖明娟 湯偉昌 管冬元 吳中華 許敏 闞衛(wèi)兵 許家佗 上海中醫(yī)藥大學(xué),27,PPT學(xué)習(xí)交流,引 言 辨證論治是中醫(yī)學(xué)的優(yōu)勢。在新形式下，如何

17、深入揭示辨證論治的機制、提高辨證論治的療效，是中醫(yī)、中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)學(xué)科的重要研究方向。 辨證論治的基礎(chǔ)研究主要借助于小鼠等實驗動物。為了滿足研究的需要，國內(nèi)學(xué)術(shù)界業(yè)已發(fā)展出200余種證候的動物模型，集中在常見的氣、血、陰、陽虛證和實熱、血瘀等實證。在很大程度上彌補了辨證論治研究動物模型的欠缺，促進了辨證論治基礎(chǔ)研究與發(fā)展。 但是迄今為止，尚缺乏小鼠四診和基于四診的辨證論治方法和技術(shù)，這成為新時期中醫(yī)藥基礎(chǔ)研究的瓶頸。,28,PPT學(xué)習(xí)交流,那么，為什么要實現(xiàn)基于四診的小鼠辨證？這是因為一些學(xué)術(shù)問題已凸現(xiàn)出來： （1）證候是體內(nèi)多系統(tǒng)、組織、細胞、分子等不同層次生物學(xué)變化外在的綜合反映。由于缺少

18、小鼠四診方法，以往有關(guān)小鼠證候判斷，主要依據(jù)實驗室檢測數(shù)據(jù)，或治療反證，一直未能建立起證候與實驗室指標一一對應(yīng)的聯(lián)系。而大量的研究表明，目前一些常用實驗室指標還不能代表證候。 （2）實驗室檢測，大多要求損傷、處死動物，如此難以動態(tài)觀察證候的自然演變和辨證論治療效。 （3）實驗室檢測，大多成本高、檢測周期長，不利于辨證論治基礎(chǔ)研究和發(fā)展的高效、批量要求。,29,PPT學(xué)習(xí)交流,（4）大量的證候動物模型、實驗室檢測和方證論治一再證明，實驗用大鼠、小鼠是存在證候的。 （5）我們長期的動物實驗，一再觀察到實驗動物大鼠、小鼠存在體質(zhì)差異，以及同病異證、異病同證的現(xiàn)象，不加辨證的單方治療，療效往往受到限制

19、，甚至?xí)a(chǎn)生副作用。 因此，我們提出，實現(xiàn)小鼠基于四診的辨證是學(xué)術(shù)發(fā)展的必然趨勢和要求。 那么，如何實現(xiàn)小鼠的四診呢？比如問診如何問？中醫(yī)四診重視面色和舌診，小鼠頭面布滿被毛，舌又不會配合地伸出來，如何望診？小鼠如何把脈？一些學(xué)者還一直對中醫(yī)四診有顧慮，不能量化，小鼠四診能否量化？對此我們開展了長期的探索和研究，結(jié)果如下：,30,PPT學(xué)習(xí)交流,圖1 正常與晚期荷瘤小鼠面容 圖2 正常小鼠 圖3 腫瘤壓迫張口呼吸小鼠,一、疾病小鼠存在證侯及其演變,31,PPT學(xué)習(xí)交流,圖4 早期荷瘤昆明種小鼠 圖5 中期荷瘤氣虛小鼠,圖6 中晚期荷瘤氣虛小鼠 圖7 中晚期荷瘤陰虛小鼠 圖8 晚期荷瘤陰陽兩虛小

20、鼠,32,PPT學(xué)習(xí)交流,以下為不同組別荷瘤小鼠爪：,圖11 爪消瘦而略紅 圖12 爪淡掌略胖,圖9 正常小鼠爪 圖10 爪淡伸展無力,33,PPT學(xué)習(xí)交流,以下為編號為H9荷瘤小鼠不同日期拍攝的爪：,圖15 腫瘤接種第2周 圖16 腫瘤接種第2.5周,圖13 腫瘤接種第1周 圖14 腫瘤接種第1.5周,34,PPT學(xué)習(xí)交流,二、正常小鼠存在體質(zhì)差異/證候差異,圖17 正常昆明種小鼠后爪 圖18 偏虛證的正常昆明種小鼠后爪,圖19 正常昆明種小鼠后爪R值的正態(tài)分布 圖20 正常昆明種小鼠體重的正態(tài)分布,35,PPT學(xué)習(xí)交流,三、小鼠如何問診 人、鼠對話是困難的，但是問診所期望采集的信息卻大多是

21、可以獲得的，而且部分信息的完整性、可靠性還優(yōu)于普通臨床上的問診。 為什么呢？眾所周知，問診歸納起來是十問：一問寒熱二問汗，三問頭身四問便，五問飲食六胸腹，七聾八渴俱當(dāng)辨，九問舊病十問因，還要參考服藥。臨床上，患者的一般情況也是問診的重要內(nèi)容。對此，小鼠可以通過以下途徑實現(xiàn)：,36,PPT學(xué)習(xí)交流,1. 問寒熱。小鼠畏寒，往往表現(xiàn)為扎堆，飼養(yǎng)中可以觀察到；畏寒的另一特點是畏寒的局部體表溫度下降，通過體表紅外成像數(shù)碼拍攝和圖像處理，可以精確定量；而體內(nèi)和體表溫度的改變，可以分別通過肛溫、腋溫、尾溫、爪溫檢測獲得。因此，以上檢測可以很好地達到問寒熱的主要目的，而且部分實現(xiàn)了量化。 2. 問汗。有報道

22、嘗試通過特殊染色技術(shù)，檢測爪面出汗點和數(shù)量多寡；有的實驗觀察了皮毛潮濕的程度，部分彌補了問汗的困難。,37,PPT學(xué)習(xí)交流,3. 問頭身。頭身的感受可以綜合兩個方面的信息獲得：1）造模方法，如果這些方法在臨床上可能造成頭身證候的，比如頭顱手術(shù)、高血壓、感冒等，可以參考；2）小鼠曠場自主探究和活動、抖攏檢測，如果頭身痛楚，則小鼠活動和探究頻率和幅度會減少。 4. 問便。飼養(yǎng)可以直接觀察大便的數(shù)量和質(zhì)量，小便可以通過代謝籠完整回收，觀測其數(shù)量和性狀。 5. 問飲食。攝食量和飲水量可以精確測量，嚙齒頻率（通過聲音采集與分析）可以部分反映其脾胃健康與否。,38,PPT學(xué)習(xí)交流,6. 胸腹。方法類似于問

23、頭身。 7. 聾。生理學(xué)有聽覺反應(yīng)檢測，可以采用；小鼠曠場、抖攏檢測可以觀察小鼠反應(yīng)的靈敏與遲鈍，間接反映其聽覺。 8. 渴。飲水量的精確測量，以及結(jié)合代謝籠尿液收集數(shù)量、顏色，判斷其可能水分通過呼吸、汗液、尿液代謝的途徑：陽熱盛往往表現(xiàn)為飲多而尿少且赤；下消則飲一溲一，等等。 9. 問舊病。實驗動物的疾病遺傳，以及疾病或證候造模方法是明確的，而臨床卻往往做不到。,39,PPT學(xué)習(xí)交流,10. 問病因。同上，而且造模藥物干預(yù)過程也是明確的。 11. 參服藥。治療干預(yù)記錄是十分明確的。 12. 一般情況。包括動物購入和實驗日期、品系、月齡、性別，飼養(yǎng)、繁殖背景等均是明確的。 因此，小鼠雖然難以實

24、現(xiàn)傳統(tǒng)意義上的問診，比如疼痛的性質(zhì)或持續(xù)時間，但問診許多重要內(nèi)容，卻是可以詳細、準確獲得的。而且，大多可以精確地定量，因而其可靠性、準確性往往還要優(yōu)于通常意義上的臨床問診。,40,PPT學(xué)習(xí)交流,四、小鼠如何望診 1. 望面色 以下圖右是正常小鼠，腫瘤虛證小鼠在左側(cè)。從圖中可以看到，正常小鼠頭部上抬，直視相機鏡頭，很關(guān)注；眼裂寬，眼色紅潤、有神；吻部飽滿、紅潤；腫瘤虛證小鼠則相反，頭低垂、目光呆滯，失去了好奇；雙目色暗；吻部瘦削、色暗滯。,21 正常與腫瘤小鼠面容與體態(tài),41,PPT學(xué)習(xí)交流,2. 望舌 清醒狀態(tài)下，小鼠舌不易自主伸出，如果強迫其伸出，必然嚴重干擾氣血運行，不符合中醫(yī)四診原則。

25、當(dāng)小鼠麻醉后，可以方便地輕輕撐開小鼠嘴，使其舌自然伸出口腔之外，采用顯微放大（8-15），是可以清晰觀察到的。其表現(xiàn)與人類舌象十分相似。血虛舌淡，陰虛陽盛舌偏紅。 但是，麻醉會干擾小鼠氣血運行；不同模型小鼠對麻醉的耐受度還不同，甚至難以接受；麻醉過深會導(dǎo)致小鼠死亡，過淺則小鼠會出現(xiàn)掙扎、不配合等等。因此，常規(guī)地開展舌診，有一定的限制。有沒有部分可以替代的方法？,42,PPT學(xué)習(xí)交流,圖22正常小鼠舌 圖23環(huán)磷酰胺模型 圖24乙酰苯肼模型 圖25甲狀腺素模型 圖26丙基硫氧嘧啶模型,圖27正常小鼠爪 圖28環(huán)磷酰胺模型 圖29乙酰苯肼模型 圖30甲狀腺素模型 圖31丙基硫氧嘧啶模型,圖32正常

26、小鼠尾 圖33環(huán)磷酰胺模型 圖34乙酰苯肼模型 圖35甲狀腺素模型 圖36丙基硫氧嘧啶模型,小鼠舌象與爪尾的比較,43,PPT學(xué)習(xí)交流,3. 望爪和尾 與人類不同，小鼠爪、尾的角化質(zhì)比較薄，可以較好地反映氣血充盈和陰陽盛衰的表現(xiàn)。以上不同模型小鼠爪、尾（8）各取自以上舌象的同一小鼠。就紅色的程度而言，各模型舌、爪、尾是一致的，爪、尾色可以部分替代舌色和面色。 將以上標準拍攝的顯微數(shù)碼照片輸入電腦，采用計算機和Photoshop7.0圖像軟件，可以對所規(guī)定的區(qū)域提取色素，圖像挖掘。所獲得的國際標準色R、G、B數(shù)值（R代表紅色，G代表綠色，B代表藍色），可以換算出紅色程度的分量值r。r=R/（R+

27、G+B）。將以上不同模型舌、爪、尾小鼠r提取并作圖如下：,44,PPT學(xué)習(xí)交流,以上結(jié)果說明： （1）舌、爪、尾顏色的變化趨勢是一致的，r值的變化趨勢也一致。 （2）反映紅色的程度，舌優(yōu)于爪、爪優(yōu)于尾。因此，要觀察氣血寒熱，優(yōu)先觀察舌、其次是爪。 （3） 通過標準顯微攝影和經(jīng)計算機圖像處理，可以實現(xiàn)部分小鼠望診的標準化、客觀化和計量化。,圖37 計算機圖像處理后各組小鼠爪、尾、舌r值,45,PPT學(xué)習(xí)交流,4. 望診其他采集內(nèi)容 包括：稱重、望形體虛實、望形體神、望形體寒熱、望運動步態(tài)、望精力、望毛色虛實、望呼吸狀況、望眼神、望耳、望鼻、望唇、望腹、望二陰、望大便、望小便、望爪、望尾、望睡眠、

28、爪和尾顯微拍照（顏色、胖瘦、光澤、爪舒展、爪伸展、爪老嫩、爪潔凈、爪潰爛）。 5.不同品系小鼠爪等的證候表現(xiàn)非常一致 以上望診方法，是否適用于常見不同品系小鼠？黑色與白色小鼠是否一致？我們比較了常用不同品系小鼠C57小鼠（黑色）、BALBc、ICR、昆明小鼠（均為白色）的四診表現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)具有很高的一致性。這一結(jié)果提示，我們所建立的望診方法是適用于常用不同品系小鼠的。,46,PPT學(xué)習(xí)交流,以下是不同品系小鼠的爪：,圖38 C57小鼠爪 圖39 BALBc小鼠爪 圖40 ICR小鼠爪 圖41 昆明小鼠爪,47,PPT學(xué)習(xí)交流,五、小鼠如何切診 1. 小鼠如何把脈 我們沒有開展小鼠把脈的研究，主要是

29、擔(dān)心會干擾其氣血運行。然而，我們建立了小鼠自然狀態(tài)下心電的快速采集。該設(shè)計思路和采集裝置已經(jīng)獲得中華人民共和國專利，專利號為：ZL03116816.7?？梢灶愃朴跈z測脈的至數(shù)與節(jié)律，如促、結(jié)、代、數(shù)、疾、緩、遲等脈象。 2. 切診的其他項目與內(nèi)容 包括體溫和膚之溫涼、腫塊的大小與質(zhì)地、肌力的強弱等，不同疾病和證候動物還會有一些特殊的檢測內(nèi)容。,48,PPT學(xué)習(xí)交流,六、小鼠如何聞診 小鼠聞診內(nèi)容目前主要為嗅氣味，聲音的標準采集和分析將有助于判斷小鼠的虛實。 七、小鼠四診的標準化、客觀化、計量化采集與分析 為實現(xiàn)小鼠非創(chuàng)傷性的標準化、客觀化、計量化四診檢測，我們提出并初步建立了小鼠四診工作站。,

30、49,PPT學(xué)習(xí)交流,1. 思路和原則 繼承中醫(yī)四診和辨證論治的理論與方法，模擬中醫(yī)臨床四診信息的采集方式，實現(xiàn)小鼠的非創(chuàng)傷性四診檢測，同時部分實現(xiàn)四診檢測的標準化、量化，提高四診檢測速度，以適應(yīng)大樣本的檢測之需。即： （1）非創(chuàng)傷性檢測； （2）標準化、客觀化、計量化； （3）可操作原則，即操作容易和方便，便于掌握和普及； （4）低成本原則，利于普及； （5）流水作業(yè)原則，以提高檢測速率。,50,PPT學(xué)習(xí)交流,2. 小鼠四診工作站內(nèi)容 （1）小鼠行為學(xué)曠場實驗檢測單元 （2）小鼠爪、尾顯微放大拍攝單元 （3）小鼠舌顯微放大拍攝單元,圖42 小鼠曠場檢測 圖42-1 小鼠爪尾顯微放大拍攝單元

31、,51,PPT學(xué)習(xí)交流,（4）小鼠自然狀態(tài)下心電快速采集單元,圖43 小鼠清醒狀態(tài)下前后肢引導(dǎo)出的心電,圖423 小鼠爪持法 圖423 小鼠尾持法,52,PPT學(xué)習(xí)交流,（5）小鼠腋溫采集單元 （6）小鼠體重采集單元 （7）小鼠整體外觀攝影單元 （8）小鼠抖攏自主活動狀況采集單元 （9）小鼠攝食量稱量單元 （10）小鼠飲水量測量單元 （11）荷瘤小鼠瘤徑的測量 （12）信息綜合處理單元 3. 小鼠四診檢測操作流程和原則 （1）操作流程 （2）操作原則,53,PPT學(xué)習(xí)交流,八、小鼠常見證候辨證標準 1四診信息的標準采集 2建立各四診信息的正常參考值 （1）建立實驗前各四診信息的正常參考值 （2

32、）建立正常對照組動態(tài)的正常參考值 （3）部分檢測數(shù)據(jù)基數(shù)校正 3癥狀歸類預(yù)處理,表1 形質(zhì)、遲動、淡、紅、青紫、瘀、寒熱癥狀類,54,PPT學(xué)習(xí)交流,表2 虛實、濕、毒、病因病邪、病態(tài)癥狀歸類,表3 五臟定位癥狀歸類,55,PPT學(xué)習(xí)交流,4常見的寒熱、虛實、氣血、陰陽、病邪、五臟證候辨證標準 （1）寒、熱、虛、實等的辨證標準,表4 寒、熱、虛、實等的辨證標準,56,PPT學(xué)習(xí)交流,（2）陰虛證、陰虛火旺、陽虛證、陰陽兩虛、氣虛證、血虛證等的辨證標準,表5陰虛證、陰虛火旺、陽虛證、陰陽兩虛、氣虛證、血虛證等的辨證標準,57,PPT學(xué)習(xí)交流,（3）部分病邪的辨證標準 （4）五臟證候的辨證標準,表

33、6 部分病邪的辨證標準,表7 五臟證候的辨證標準,58,PPT學(xué)習(xí)交流,目前，我們已經(jīng)編寫出方法學(xué)專著： 辨證論治實驗方法學(xué)實驗小鼠診法與辨證,59,PPT學(xué)習(xí)交流,九、發(fā)表的學(xué)術(shù)論文 1. 方法學(xué)學(xué)術(shù)論文 1 方肇勤, 潘自強, 付曉伶, 等. 小鼠四診采集項目標準的建議. 中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志, 2005, 11(9): 692-694 2 方肇勤. 昆明種小鼠辨證標準的建議. 全國辨證論治研討會(上海)2004,3. 3 方肇勤,潘志強,湯偉昌,等. 小鼠四診工作站構(gòu)建與操作標準. 上海中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報, 2006, 20(1) 4 潘自強, 方肇勤, 闞衛(wèi)兵, 等. 正常昆明種小鼠后爪圖

34、譜及RGB值. 上海中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報, 2003,17(3):46-47 5 潘自強, 方肇勤, 闞衛(wèi)兵, 等. 荷瘤小鼠后爪部分證的標志圖譜. 中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志, 2004, 10(2): 27-29 6 潘自強, 方肇勤, 付曉伶, 等. 荷瘤小鼠若干典型證的演變及其后爪圖像特征. 上海中醫(yī)藥雜志, 2004, 10(6): 62-64 7 潘志強,盧文麗,方肇勤. 小鼠舌象的顯微拍攝(待發(fā)表) 8 盧文麗,方肇勤,潘志強,等. 小鼠氣、血、陰、陽、虛等四種模型四診的比較和評價(待發(fā)表) 9 盧文麗,方肇勤,潘志強,等. 小鼠氣、血、陰、陽、虛等八種模型四診的比較和評價(待發(fā)表),60,PPT學(xué)習(xí)交流,2. 荷瘤小鼠辨證論治學(xué)術(shù)論文 10 李海燕, 方肇勤. 中西藥對移植性肝癌小鼠的生存率、抑瘤率等作用的比較研究. 第四屆全國肝癌診療進展學(xué)術(shù)會議論文集, 1999.108 11 陳曉,方肇勤. 神經(jīng)內(nèi)分泌免疫網(wǎng)絡(luò)在虛證實驗動物中的變化. 上海中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報, 2002,16(2): 61-65 12 陳德溯,陳曉,方肇勤. 建立荷瘤小鼠分期