1、非 腫 瘤 疾 病 的 基 因 治 療,1,PPT學(xué)習(xí)交流,一、免疫系統(tǒng)和溶酶體儲積病 在1992年3月,意大利科學(xué)家首次應(yīng)用攜帶DNA的逆轉(zhuǎn)錄病毒處理的骨髓干細(xì)胞,治療腺苷脫氨酶(ADA)缺陷病獲得成功后，1993年3月，英國、法國與荷蘭的科學(xué)家合作，用類似的方法治療其它先天性免疫缺陷病，如T淋巴細(xì)胞病、嘌呤核苷磷酸化酶缺乏癥、白細(xì)胞粘著缺陷病和慢性肉芽腫病等奠定了基礎(chǔ)。 實(shí)驗(yàn)表明, 溶酶體儲積病也可基因轉(zhuǎn)移到骨髓干細(xì)胞的方法進(jìn)行治療，常見的糖原儲積癥、脂儲癥等大約10余種基因異常的儲積病，基因治療用于臨床上出現(xiàn)不可逆的神經(jīng)系統(tǒng)損傷之前，而且新基因在骨髓干細(xì)胞中能夠長期、穩(wěn)定的表達(dá)。這種表達(dá)

2、可以矯正病人的遺傳缺欠，這是治療的關(guān)鍵。,2,PPT學(xué)習(xí)交流,可用造血干細(xì)胞基因治療的某些細(xì)胞譜系疾病 疾病 遺傳特點(diǎn) 需要補(bǔ)充的酶 靶細(xì)胞 腺苷脫氨酶缺乏癥 常染色體隱性 腺苷脫氨酶 淋巴細(xì)胞 高雪氏病 常染色體隱性 葡糖腦苷脂酶 巨噬細(xì)胞 慢性肉芽腫病 X-連鎖 NADPH氧化酶 粒細(xì)胞 地中海貧血 常染色體隱性 -株蛋白 紅細(xì)胞,3,PPT學(xué)習(xí)交流,二、人體免疫缺陷病毒感染 人體感染（HIV）后，主要是損害T淋巴細(xì)胞，使人體喪失免疫功能。引起系列感染、死亡。所以基因治療HIV感染的首要任務(wù)是改變受損的T淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，恢復(fù)其正常功能。從1992年起，治療HIV感染的5項(xiàng)基因轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)已

3、經(jīng)開始。盡管將單純皰疹病毒胸苷激酶作為“自殺”基因，轉(zhuǎn)移到感染HIV的T淋巴細(xì)胞，對病人有一定的不良反應(yīng)，但能夠破壞體內(nèi)含有HIV的T淋巴細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)需要從感染HIV和伴發(fā)淋巴細(xì)胞瘤病人的血液中分離與克隆T細(xì)胞，載體外細(xì)胞培養(yǎng)中進(jìn)行遺傳學(xué)修飾，使之成為抵抗感染HIV的T淋巴細(xì)胞，然后在靜脈輸回給病人。 另有2組實(shí)驗(yàn)，直接注射含有HIVB包膜基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒到肌肉，希望能夠誘發(fā)機(jī)體的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞對肌肉中HIVB表達(dá)蛋白質(zhì)的免疫反應(yīng)等許多研究在進(jìn)行中。截至目前為止，尚無一種方法能在組織細(xì)胞培養(yǎng)中，完全阻斷HIV的表達(dá)。因此，聯(lián)合應(yīng)用不同的方法，提高機(jī)體免疫力，可能會達(dá)到滿意的效果。,4,PP

4、T學(xué)習(xí)交流,三、重組體疫苗 科學(xué)家希望通過直接注射DNA來制造疫苗,預(yù)防各種疾病.目前用遺傳學(xué)的方法可以修飾抗原的DNA,如融合細(xì)胞素基因以增加抗原性，改變微生物的基因或用重組病毒載體攜帶DNA等。 修飾微生物的基因主要有兩種方式，一是去掉致病或生物體存活所必需的基因，使其從遺傳學(xué)上喪失能力。二是插入一個(gè)外源性基因，這種基因可在細(xì)菌或寄生蟲中表達(dá)。例如刪除沙門氏菌存活所必需的基因片段，制成疫苗，口服后可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫，且不至病。 卡介苗使人們廣泛應(yīng)用的免疫媒介物，它有著20億人次應(yīng)用的良好紀(jì)錄和刺激免疫的作用。卡介苗能夠重組，插入病毒（如HIV），寄生蟲（如血吸蟲）或腫瘤的基因片段，形成疫苗

5、。例如插入血吸蟲基因到卡介苗基因組，在動物實(shí)驗(yàn)中，可刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體，有效地預(yù)防血吸蟲感染。這種疫苗的應(yīng)用價(jià)值巨大，世界上有大約二百萬人患血吸蟲病。,5,PPT學(xué)習(xí)交流,另一組實(shí)驗(yàn)是直接轉(zhuǎn)送帶有病毒載體的基因進(jìn)入人體內(nèi)，近來用狂犬病抗原重組的牛痘病毒接種動物，可以預(yù)防烷熊和狐貍的狂犬病感染，但在人類會產(chǎn)生較為嚴(yán)重的副作用，有待牛痘病毒的進(jìn)一步基因重組。 基因重組載體具有以下優(yōu)點(diǎn)： 1.載體可以含有多種不同的抗原，因此降低了各種單一免疫制劑的量。 2.重組載體攜帶的基因，不僅可以是感染的抗原基因，也可包括腫瘤和自身抗原基因。 3.可以除去微生物的毒性基因和致病力基因，最大限度地減少了人體應(yīng)用時(shí)的

6、副作用。 4.應(yīng)用各種不同的生物體，可以進(jìn)行大量的基因轉(zhuǎn)移，延長免疫持續(xù)時(shí)間，并且很容易轉(zhuǎn)送到大量的人群。 總的來說，在下一個(gè)10年，使用重組疫苗將是人體基因治療的最重要部分。,6,PPT學(xué)習(xí)交流,四、造血系統(tǒng) 基因治療血液病已有好些年了，本段將介紹血紅蛋白疾病?；蛑委熝t蛋白疾病是比較復(fù)雜的，目前還不能控制血紅蛋白產(chǎn)物的量。對于地中海貧血，主要是插入一個(gè)-珠蛋白基因，改善貧血。這種新的-珠蛋白基因能產(chǎn)生一定量的-珠蛋白，相當(dāng)于細(xì)胞產(chǎn)生的-珠蛋白。如果植入的基因不能產(chǎn)生相當(dāng)于細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生-珠蛋白量的-珠蛋白，病人仍然貧血。 近來基因療法的研究集中在如何將基因控制區(qū)（locus control

7、region）放入載體，這個(gè)區(qū)域可以調(diào)節(jié)-珠蛋白產(chǎn)生與細(xì)胞-珠蛋白相當(dāng)?shù)牧?。一旦能植入這個(gè)有調(diào)節(jié)功能的部分，并能表達(dá)其功能，幾千位地中海貧血病人將會得到有效的治療。,7,PPT學(xué)習(xí)交流,鐮狀細(xì)胞貧血的基因矯正類似與地中海貧血，這兩種貧血都需要調(diào)節(jié)功能性-珠蛋白基因。另外，鐮狀細(xì)胞貧血還需要找到一種方法，能關(guān)閉血紅蛋白的S基因。 范可尼C型貧血（Fanconis anemia type C）的治療尚未應(yīng)用于病人。這種治療方法是采用逆轉(zhuǎn)錄病毒運(yùn)載范可尼貧血C補(bǔ)體（Fanconi anemia C-complementing FACC）基因進(jìn)入人外周血的造血祖細(xì)胞。體外研究顯示，這種基因進(jìn)入FACC

8、缺陷病人的細(xì)胞內(nèi)（約占15%的病人），可引起祖細(xì)胞增多。這種病人常在獲得合適的捐贈骨髓之前，死于骨髓發(fā)育不全和急性白血病，因此給與正常的干細(xì)胞可能會對存活有益。,8,PPT學(xué)習(xí)交流,五、肺系統(tǒng) 目前尚沒有辦法在實(shí)驗(yàn)中常規(guī)培養(yǎng)肺細(xì)胞，因此不能在體外進(jìn)行基因修飾，現(xiàn)在的基因轉(zhuǎn)移主要在體內(nèi)進(jìn)行。肺系統(tǒng)的基因治療集中在囊性纖維化?。–ystic Fibrosis，CF）。本病為常染色體隱性遺傳，在不同種族人群中差異很大。英國的隱性遺傳基因攜帶率為1/22，臨床發(fā)病率為千分之一。亞洲較少見，發(fā)病率約為10萬分之一。囊性纖維化病是由于患者的腺上皮功能失調(diào)，氯離子不能排除腺上皮細(xì)胞膜，鈉離子不能進(jìn)入，使腺上

9、皮表面被一層粘稠的分泌物覆蓋，以至阻塞腺管。本病主要累及呼吸道和消化道。 1985年發(fā)現(xiàn)囊性纖維化病的CF基因位點(diǎn)在7q31-32，1989年加拿大多倫多一組人員證實(shí)了本病是因編碼細(xì)胞膜上形成氯化物通道的一個(gè)大蛋白質(zhì)的基因-囊性纖維化超膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)物（CFTR）發(fā)生突變所至。現(xiàn)在已有六組進(jìn)行人體的臨床試驗(yàn)。,9,PPT學(xué)習(xí)交流,六、心血管系統(tǒng) 先天性心血管疾病的基因治療尚有困難，它不是單一基因疾病，如果發(fā)現(xiàn)它與基因突變有關(guān)，遺傳矯正也需要在心臟結(jié)構(gòu)形成之前進(jìn)行。 家族性高膽固醇血癥是應(yīng)該進(jìn)行基因治療的。本病是常染色體隱性遺傳，發(fā)病率約為百萬分之一。由于缺乏低密度脂蛋白受體（LDLr），使血清膽固

10、醇明顯升高，引起兒童期的冠狀動脈心臟病。1992年密西根大學(xué)首先開始這項(xiàng)工作，手術(shù)切除病人的一部分肝臟，約200-300g，體外肝細(xì)胞培養(yǎng)，用攜帶LDLr基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體修飾病人的肝細(xì)胞，然后把修飾后的帶有LDLr的肝細(xì)胞通過肝動脈輸回肝內(nèi)。早期結(jié)果顯示，病人血清膽固醇水平下降20%-40%，并提高了機(jī)體對膽固醇藥物的反應(yīng)。在治療的三個(gè)病人中，沒有發(fā)現(xiàn)基因載體的毒性作用。 另一個(gè)研究是心肌梗塞后，心肌纖維的心血管形成。學(xué)者們研究一種能形成心血管的基因，如成纖維細(xì)胞生長因子（FGF），動物實(shí)驗(yàn)中顯示可喜的結(jié)果。目前正在探索基因轉(zhuǎn)送的方法和形成心血管的確實(shí)作用。,10,PPT學(xué)習(xí)交流,七、肝系

11、統(tǒng) 基因轉(zhuǎn)移到肝臟是基因治療研究的另一個(gè)領(lǐng)域，一些與肝臟有關(guān)的遺傳性疾病，需要考慮基因治療。這些病包括-1-抗胰蛋白缺乏癥，凝血因子和缺乏和血友病。這些基因可在體內(nèi)和體外的多種細(xì)胞中表達(dá)。目前的困難是缺乏一種體內(nèi)基因轉(zhuǎn)送的方法，使新基因在肝臟細(xì)胞中有較長時(shí)間的表達(dá)。 第一個(gè)用基因轉(zhuǎn)移到人體肝細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)是在家族性高膽固醇血癥（famlial hypercholesterolemia，F(xiàn)H）病人，用體外轉(zhuǎn)錄基因的方法將鼠逆轉(zhuǎn)錄病毒攜帶的低密度脂蛋白受體基因轉(zhuǎn)移進(jìn)入體外培養(yǎng)的肝細(xì)胞，然后通過肝導(dǎo)管把基因改變的肝細(xì)胞注入回肝臟，效果很好。,11,PPT學(xué)習(xí)交流,八 目前存在的問題 (一)安全性 應(yīng)用病

12、毒載體進(jìn)行基因治療的安全性已有較多研究。 1.是感染， 2.是有益基因的丟失， 3.是誘發(fā)癌變。 應(yīng)用的病毒在使用之前必須經(jīng)過重組，去除本身的致病DNA片斷， 感染性很低在再轉(zhuǎn)移基因進(jìn)入細(xì)胞的過程中，有益基因丟失的可能 性也很低。美國舊金山一組科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，逆轉(zhuǎn)率病毒進(jìn)入靶細(xì)胞后 ，只有十萬分之一的可能性失去細(xì)胞的有益基因。,12,PPT學(xué)習(xí)交流,關(guān)于誘發(fā)癌變，人體內(nèi)細(xì)胞中固有的原癌基因，都具有特異性 的激活因素，目前尚未發(fā)現(xiàn)已經(jīng)采用的病毒有激活原癌基因， 或掩蓋抑癌基因的作用。這需要臨床和實(shí)驗(yàn)室的長期觀察和證實(shí)。 （二）穩(wěn)定性目前在動物實(shí)驗(yàn)和人的臨床治療中，基因通過 媒介物進(jìn)入靶細(xì)胞后，基因表

13、達(dá)不穩(wěn)定，甚至不表達(dá)。靶細(xì)胞 在復(fù)制時(shí)，新基因可能丟失。這可能是由于：基因轉(zhuǎn)錄系統(tǒng) 不穩(wěn)定；形成不正確的信息RNA；基因表達(dá)的控制因素復(fù)雜； 靶細(xì)胞死亡，產(chǎn)生毒素等。 （三）免疫性 臨床治療時(shí)需要反復(fù)多次注射、噴霧或灌注，使機(jī)體產(chǎn)生免疫 反應(yīng)，排斥攜帶基因的病毒或靶細(xì)胞,給進(jìn)一步治療造成困難.為減 少免疫反應(yīng),有的科學(xué)家已將一種重組基因的腺 病毒,13個(gè)月后,再換 用另一種.可以避免免疫反應(yīng)發(fā)生。,13,PPT學(xué)習(xí)交流,（四）倫理問題 基因治療的作用顯著，但仍有一定的局限性和潛在的危險(xiǎn)性， 必須嚴(yán)格控制，只能在人員和設(shè)備完善的條件下進(jìn)行。在美國， 如果需要進(jìn)行人體的基因治療，必須經(jīng)過以下四各委

14、員會批準(zhǔn)： 倫理小組、生物安全小組、重組DNA咨詢委員會（RAC）及食 品和藥物管理局（FDA）。另外，目前基因治療只限于應(yīng)用常 規(guī)治療存活不超過10年者，并不準(zhǔn)用于胎兒。 九展望 為了使基因治療更廣泛的開展，必須解決如下問題： 1 改善載體的設(shè)計(jì) 2 提高基因載體轉(zhuǎn)移到靶細(xì)胞的效率 3 建立更理想的傳送系統(tǒng)，例如通過導(dǎo)管可將基因載體 直接送到病變部位 4 能夠觀測宿主細(xì)胞和載體之間的相互作用，建立穩(wěn)定、 持久的基因表達(dá)及表達(dá)調(diào)節(jié)系統(tǒng) 5 最大限度地減少載體對病人的危險(xiǎn)性,14,PPT學(xué)習(xí)交流,小 結(jié): 1.試述人體感染(HIV)大地基因治療的設(shè)想? 2.基因重組載體具有哪些優(yōu)點(diǎn)? 3.目前,能夠?qū)υ煅到y(tǒng)、肝系統(tǒng)、肺系統(tǒng)、 心血管系統(tǒng)中哪些疾病可初探開展基因治療？