1、微量殘留病檢測在急性白血病 分層治療中的意義,MRD:The leukemic population undectable by morpglogic methods has been defined as MRD,Minimal Residual Disease (MRD),MRD is a term used when there is evidence( immunophenotypic, molecular, or cytogenetic) that leukemic cells remain in the BM but there are insufficient cells to

2、be detected by routine examination under the microscope.,MRD檢測的方法,MRD監(jiān)測的臨床意義,MRD 檢測在分層治療中的意義,FCM-MRD檢測的結果,MRD檢測方法,PCR: 基因-定性、 定量（RQ-PCR） b.多參數(shù)FCM：免疫標志,發(fā)病時尋找免疫標志和基因標志進行檢測,目的基因：融合基因：BCR/ABL,AML1/ETO,PML/RAR 基因重排： IgH，TCR(10-4-10-5) 基因突變：FLT3-ITD,NPM1(10-5) 基因表達增加：WT1,PRAME(10-3) 優(yōu)點： 靈敏度高-10-5-10-6/5 c

3、opes /10-5 特異性強 缺點: 1. 融合基因：應用范圍有限： ALL:10-30%，AML:30-50% 2. IgH/TCR : 90%, 操作復雜，費時,需要基因測序，特異引 物/探針(每例患者特異） 3.容易污染，出現(xiàn)假陽性。,RQ-PCR檢測MRD特點,優(yōu)點： 靈敏：ALL-10-4 , AML-10-3-10-4 （獲取細胞相關） 定量單位：細胞% 快速：檢測當天即可知結果 操作簡便 應用范圍廣：90% 缺點： 表型的變化:假陰性 受前體B細胞(Hematogones)的干擾： 形態(tài)幼稚，表達CD34,TDT 在小兒、化療后、SCT后比例增加5% 需要較高的分析水平和技能

4、應用不夠廣泛，需要建立標準化操作,FCM MRD檢測的特點,定義：正常骨髓/PB中不表達或表達比例較低的 免疫表型,白血病相關的免疫表型(LAIP) （Leukemia Associated ImmunoPhenotype）,FCM-MRD：白血病細胞的特異抗原：NG2(7.1),IM/MRD檢測的抗原CD34,CD33-：正常分化抗原：表達于正常細胞的不同系列、分化階段（非白血病細胞所特異）,交叉系列抗原: B、T、髓、NK細胞抗原 非同期抗原共表達: CD15/CD117 CD34/CD64 抗原表達量異常：表達強度過高、過低或不表達 異常的光散射信號：FSC和SSC,LAIP的分類,基礎

5、：熟悉正常細胞不同分化階段抗原出現(xiàn)的順序 和表達量的規(guī)律,Cytometry (communications in Clinical cytometry)38:139-152(1999),誘導緩解后MRD水平與累計復發(fā)率,Coustan-Smith E.BLOOD,2000;96:2691,Johns Hopkins,Most information displays No. of cases(%) A CD19/CD45/CD20/CD10 (N=82) CD45 vs CD10 48(59) FSC vs CD10 13(16) FSC vs CD20 11(13) CD10 vs CD2

6、0 4(5) 76(93) B CD19/CD45/CD9/CD34 (N=77) CD45 vs CD34 27(35) FSC vs CD34 17(22) CD34 vs CD9 16(21) 72(94) A+B 81(99),Leukemia(1999)13,558-567,A Childrens Oncology Group Study（FCM-MRD),Blood.2008;111:5477,誘導緩解后MRD檢測的意義（D29）, N=2134,誘導后 MRD水平對早期和晚期復發(fā)的影響,Relapse-free survival,Years,NCI SR 伴好遺傳學特性患者MRD

7、與EFS關系,Years,Years,4,10,8 天PB MRD的意義,多變量分析,鑒別預后非常好的一組患者,NCI-SR+ DT TEL-AML1+ MRD- D8 and D29,12%,成人-ALL-FCM,Blood.2003;10:4695,CD7/CD5/CD3 CD4/CD8/CD3 CD7/CD2/CD3 CD7/CD34/CD38,Spain,MRD水平與RFS,11.76%(n=12/102), Day 14 MRD-/0.03%, RFS OF 90% at 5 years,對RFS的多變量分析,Status of minimal residual disease af

8、ter induction predicts outcome in both standard and high-risk Ph-negative adult acute lymphoblastic leukaemia. The Polish Adult Leukemia Group ALL 4-2002 MRD Study N=116,British Journal of Haematology, 2008:142, 227,CD7/CD2/CD3 CD7/CD5/CD3 CD7/CD38/CD34 CD7/CD4/CD8 TDT/CD7/Ccd3 CD7/CD1a/CD3 cCD3/CD7

9、/CD3,CD10/CD20/CD19 CD34/CD22/CD19 CD34/CD38/CD19 CD45/CD34/CD19 TDT/CD10/CD19 CD58/CD52/CD19 CD33/CD13/CD19 CD15/CD117/CD19 CD65/CD56/CD19 CD7/CD2/CD10,B-ALL,T-ALL,誘導緩解后 MRD與復發(fā)關系,誘導后 MRD狀態(tài)與治療的關系,對復發(fā)率和leukaemia free-survival的多變量分析,Risk and response-based classification of childhood B-ALL,Childrens O

10、ncology Group (COG),Blood: 2007; 109: 926935.,Retrospective,CCG:1988-1995,POG:1986-1999,N=6238,Age:1-22y,COG risk classification scheme,Risk factors: Age:10 y WBC:50000/L Cytogenetics:TEL/AML1,Trisomies(4,10.17),BCR/ABL,MLL, Day-14 marrow response:M125% blast Day-29 MRD-FCM CNS/TD,Childhood B-Precur

11、sor-ALL,Age:10,WBC:50000/L,:High Risk,:Standard Risk,TEL/Tris,D8/15,29 BM,D29MRD, CNSorTD/MLL,+, M1,M1 0.1%.-/n,Low Risk,-, M1,M1 0.1% -/n,+-,D15 M2/3, 0.1-1.0%.+/+,SR,HR,D8/15 BM,D29BM/MRD, CNS orTD/MLL,+,M1,M1 0.1%.-/n,D15 M2/3, 0.1-.0%.+/+,HR,HR,Randomized,Augmented,Augmented,BCR/ABL.MLL+SER.DI1.

12、0%+D43-M2,3/MRD1.0%,VHR,Risk and response-based classification of childhood B-ALL,Blood: 2007; 109: 926935.,Pediatric Oncology Group (POG),Childrens Cancer Group (CCG),Risk and response-based classification of childhood B-ALL,IgH TCR基因的陽性率和敏感性,T Flohr，Leukemia (2008) 22, 771782,AIEOP-BFM ALL 2000,PC

13、R MRD指導的危險度分層,AIEOP-BFM ALL 2000化療流程,MRD指導的分層標準,HR:PPR;NR,BCR/ABL,MLL/AF4,QR-PCR 檢測MRD流程,Event-free survival,cumulative incidence of relapse,Blood.2010;115:3206,Molecular response to treatment redefines all prognostic factors in children and adolescents with B-cell precursor acute Lymphoblastic leuk

14、emia:results in 3184 patients of the AIEOP-BFM ALL 2000 study,TEL/AML1+,favorable DNA index ( 1.16 and 1.6),PCR-MRD對預后好患者的影響,PCR-MRD 對Ph+ 患者的影響,SR,IR,HR,PCR-MRD 對Ph-患者的影響,多變量分析,CML歐洲白血病網(wǎng)(ELN) 最新推薦,伊馬替尼400mg/d初始治療失敗的定義: 3個月未達到CHR, 6 個月未達到任何CyR, 12個月未達到PCyR, 18個月未達到CCyR, 任何時間, 丟失之前達到的CCyR或CHR 疾病進展或出現(xiàn)耐

15、藥的Abl激酶突變 推薦采用第二代TKI尼洛替尼治療,慢性期,加速/急變期,NCCN最新版治療指南推薦,對于伊馬替尼400mg/d初始治療患者，出現(xiàn)以下事件推薦患者接受尼洛替尼治療: 3個月未達到血液學反應或者血液學復發(fā), 6 個月未達到任何CyR, 12個月未達到PCyR或者細胞遺傳學復發(fā), 18個月未達到CCyR或者細胞遺傳學復發(fā),CML患者CCR后BCR-ABL mRNA動態(tài)變化與imatinib應用,Qin YZ,Liu YR,Zhu HH,et al. Int J Lab Hematol 2008;30:317,“”：CCR “”：Ph+,其中1例患者由CCR進展至急變期，BCR-A

16、BL升高2.5log,但未檢測出Ph染色體,Qin YZ,Liu YR.Zhu HH.et al. Int J Lab Hematol 2008;30:317,CML患者CCR后的BCR-ABLmRNA水平提示復發(fā),空心：CCR， 實心：Ph +,正常B細胞的分化規(guī)律,北京大學人民醫(yī)院血液病研究所,CD10 CD34 CD19與 CD45 關系,CD22 CD20 CD19與 CD45關系,CD38 CD58 CD19與 CD45關系,I: CD34+CD10+ cIg- sIg- (Com-B-ALL) II:CD34-CD10+ cIg+ sIg- (pre-B-ALL) III: CD3

17、4-CD10- cIg+ sIg+(mature B-ALL),Note : no CD19+CD10-CD34+(Pro-B-ALL),成人與兒童B-ALL各亞型中LAIP 發(fā)生率,363/403(90.1),236/262(90.1),127/141(90.1),總,8/15(53.3)e,8/12(69.2)c,0/3(0)a,成熟 -/-,59/75(78.7)d,35/46(76.1)b,24/29(82.8),Pre -/+,238/255(93.3),148/159(93.1),90/96(93.8),Com +/+,58/58(100),45/45(100),13/13(100

18、),Pro +/-,總,成人,兒童,CD34/CD10,B-ALL,亞型,中國實驗血液學雜志 2006；14：853,Campana. Cytometry 38:139-152(1999),MRD+0.1%,CD45-CD10st+CD34s+,分析全部CD19+的細胞， 以Hematogones作為內(nèi)對照 觀察每個雙參數(shù)的圖形， 無僵硬設門 優(yōu)點：避免表型改變所致假陰性 不依賴于發(fā)病時的IM 缺點：不易掌握,4色FCM檢測B-ALL MRD的臨床意義,98例：兒童78，成人20 ，671份標本，6.8 次/人，10.8月 /人， 3.1月/次,中國血液學雜志 2006；27：302,兩組四色

19、抗體：通用：CD34/CD10/CD45/CD19 個體化：CD38,CD123,CD13,CD33,CD58,CD20/CD45/CD19 無IM: CD20/CD22/CD45/CD19 or CD20/CD38/CD45/CD19,連續(xù)監(jiān)測，間隔3M。如MRD+？,需要證實時，在2W。,發(fā)病1-3個月MRD+和MRD-患者累計復發(fā)率,P=0.001,12歲 女 Pro-B-ALL 連續(xù)檢測結果,MRD+=0.45%,7色-FCM-MRD-B-ALL,CD10/CD34/CD123/CD38/CD58/CD45,CD19,CD19,CD10,CD10,CD34,CD38,CD10,CD58

20、,CD34,CD45,CD45,CD123,CD123,CD10,CD45,CD45,SSC,SSC,AML MRD檢測,NBM-CD34+細胞亞群分析,CD7,CD56,CD3,CD33,CD38,CD15,CD1b,CD13,CD19,HLA-DR,CD117,HLA-DR,CD34,正常骨髓CD34+/SSClow CD117+/SSClow細胞中的抗原表達（xSD）,中華血液學雜志2008；29：121,610例AML和正常骨髓中LAIP細胞的表達差異,中華血液學雜志2007；28：731,19種抗體，四色組合，LAIP+=86%,診斷時AML M2患者,特點：SSC小CD117+CD

21、33+CD13-HLA-DR- LAIP: CD117+CD34-CD33+HLA-DR-和CD117+CD34-CD33+CD13-,診斷后23個月（CR） MRD（+）=0.25%,診斷后27個月（CR）MRD（+）=0.80%,AML治療后MRD(+) 和 MRD(-) 患者RFS,3-4M,1-2M,5-6M,中國實驗血液學雜志 2009;17:551,N=95 AML 601份BM LAIP+,MRD+=0.33%,7色-FCM-MRD-AML,CD56/CD19/CD33/CD34/CD117/CD45,CD34,CD38,CD56,CD117,CD34,CD56,CD19,CD19,CD33,CD33,CD33,CD33,CD