1、,Copyright 2010 by Ouyang Hongsheng. All rights reserved.,生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù) Methods in Biochemistry,郝林琳 動(dòng)物生物技術(shù)系 吉林大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院 Tel主要內(nèi)容：技術(shù)理論 10學(xué)時(shí)第一章 生物化學(xué)樣品制備技術(shù) 第二章 沉淀技術(shù)第三章 膜分離技術(shù)第四章 色譜技術(shù)第五章 分光光度技術(shù) 第六章 離心技術(shù) 第七章 電泳技術(shù) 第八章 印跡技術(shù)實(shí)驗(yàn) 50學(xué)時(shí),Copyright 2010 by Ouyang Hongsheng. All rights reserved.,第一章 生物化學(xué)樣品制備

2、技術(shù),郝林琳 動(dòng)物生物技術(shù)系 吉林大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院 Tel第一章 生物化學(xué)樣品制備技術(shù),概念 從生物 材料中獲得某一組分的方法稱為生物化學(xué)制備技術(shù)。它是生化工程、生化制藥及生化分析的基礎(chǔ)。 意義 生物分子制備是研究生物分子特別是生物大分子的前提 。,第一節(jié)生物化學(xué)樣品制備特點(diǎn),與化學(xué)產(chǎn)品的分離制備相比較，生物大分子的制備有以下主要特點(diǎn)： 生物材料的組成極其復(fù)雜，常常包含有數(shù)百種乃至幾千種化合物。 許多生物大分子在生物材料中的含量極微，分離純化的步驟繁多，流程長(zhǎng)。 許多生物大分子一旦離開了生物體內(nèi)的環(huán)境時(shí)就極易失活，因此分離過程中如何防止其失活，就是生物大分子提取制

3、備最困難之處。 生物大分子的制備幾乎都是在溶液中進(jìn)行的，溫度、pH值、離子強(qiáng)度等各種參數(shù)對(duì)溶液中各種組成的綜合影響，很難準(zhǔn)確估計(jì)和判斷。,第一節(jié)生物化學(xué)樣品制備特點(diǎn),(5)為保護(hù)所提取物質(zhì)的生理活性及結(jié)構(gòu)上的完整性，生化分離方法多采取溫和的“多階式”進(jìn)行。常常少至幾個(gè)多至幾十個(gè)步驟，并不斷變換各種分離方法，才能達(dá)到純化目的。 (6)生化分離方法的最后均一性的證明與化學(xué)上純度的概念并不完全相同，其均一性的評(píng)定常常是有條件的或者只能通過不同角度測(cè)定，最后才能給出相對(duì)的“均一性”結(jié)論。,第二節(jié) 生化分離制備實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),生物大分子的制備通?？砂匆韵虏襟E進(jìn)行： 確定要制備的生物大分子的目的和要求：是進(jìn)行科

4、研、開發(fā)還是要發(fā)現(xiàn)新的物質(zhì)。 建立相應(yīng)的可靠的分析測(cè)定方法，這是制備生物大分子的關(guān)鍵。 通過文獻(xiàn)調(diào)研和預(yù)備性實(shí)驗(yàn)，掌握生物大分子目的產(chǎn)物的物理化學(xué)性質(zhì)。 生物材料的破碎和預(yù)處理。 分離純化方案的選擇和探索，這是最困難的過程。 生物大分子制備物的均一性（即純度）的鑒定，要求達(dá)到一維電泳一條帶，二維電泳一個(gè)點(diǎn)，或HPLC和毛細(xì)管電泳都是一個(gè)峰。 產(chǎn)物的濃縮，干燥和保存。,分析方法,分析測(cè)定方法有兩類：生物學(xué)和物理、化學(xué)的測(cè)定方法。 生物學(xué)的測(cè)定法主要有：酶的各種測(cè)活方法、蛋白質(zhì)含量的各種測(cè)定法、免疫化學(xué)方法、放射性同位素示蹤法等； 物理、化學(xué)方法主要有：比色法、氣相色譜和液相色譜法、光譜法（紫外可

5、見、紅外和熒光等分光光度法）、電泳法、以及核磁共振等。 實(shí)際操作中盡可能多用儀器分析方法，以使分析測(cè)定更加快速、簡(jiǎn)便。,掌握生物分子的物理、化學(xué)性質(zhì),要了解的生物大分子的物理、化學(xué)性質(zhì)主要有： 在水和各種有機(jī)溶劑中的溶解性。 在不同溫度、pH值和各種緩沖液中生物大分子的穩(wěn)定性。 固態(tài)時(shí)對(duì)溫度、含水量和凍干時(shí)的穩(wěn)定性。 各種物理性質(zhì)：如分子的大小、穿膜的能力、帶電的情況、在電場(chǎng)中的行為、離心沉降的表現(xiàn)、在各種凝膠、樹脂等填料中的分配系數(shù)。 其他化學(xué)性質(zhì)：如對(duì)各種蛋白酶、水解酶的穩(wěn)定性和對(duì)各種化學(xué)試劑的穩(wěn)定性。 對(duì)其他生物分子的特殊親和力。,利用性質(zhì)差異設(shè)計(jì)純化方法,制備生物大分子的分離純化方法多

6、種多樣，主要是利用它們之間特異性的差異，如分子的大小、形狀、酸堿性、溶解性、溶解度、極性、電荷和與其他分子的親和性等。 各種方法的基本原理可以歸納為兩個(gè)方面： 利用混合物中幾個(gè)組分分配系數(shù)的差異，把它們分配到兩個(gè)或幾個(gè)相中，如鹽析、有機(jī)溶劑沉淀、層析和結(jié)晶等； 將混合物置于某一物相（大多數(shù)是液相）中，通過物理力場(chǎng)的作用，使各組分分配于不同的區(qū)域，從而達(dá)到分離的目的，如電泳、離心、超濾等。 目前純化蛋白質(zhì)等生物大分子的關(guān)鍵技術(shù)是電泳、層析和高速與超速離心。,第三節(jié) 生物大分子的提取,一、選擇材料及預(yù)處理 二、細(xì)胞的破碎 三、抽提,一、選擇材料及預(yù)處理 材料選擇應(yīng)遵循的原則是，有效成分含量多、穩(wěn)定

7、性好；來源豐富、保持新鮮；提取工藝簡(jiǎn)單、有綜合利用價(jià)值等。,1.動(dòng)物組織： 選材：必須選擇有效成分含量豐富且易分離的臟器組織為原材料。如磷酸單酯酶，從含量看，雖然在胰臟、肝臟和脾臟中較豐富，但是因其與磷酸二酯酶共存，進(jìn)行提純時(shí)，這兩種酶很難分開。所以實(shí)踐中常選用含磷酸單酯酶少，但幾乎不含磷酸二酯酶的前列腺作材料。 脫脂：臟器中含量較高的脂肪，容易氧化酸敗，導(dǎo)致原料變質(zhì)影響純度操作和制品得率。常用的脫脂方法有：人工剝?nèi)ヅK器外的脂肪組織；浸泡在脂溶性的有機(jī)溶劑（丙酮，乙醚）中脫脂；采用快速加熱（50左右），快速冷卻的方法，使溶化的油滴冷卻后凝聚成油塊而被除去。,1.動(dòng)物組織： 保存：對(duì)預(yù)處理好的材

8、料，若不立即進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，應(yīng)冷凍保存。 a.冰凍：剝?nèi)ブ竞徒钇さ冉Y(jié)締組織，短期保存：-10的冰箱內(nèi)；長(zhǎng)期保存：-70低溫冰箱內(nèi)。 b.干燥：對(duì)于像腦垂體一類小組織，可置丙酮液中脫水，干燥后磨粉儲(chǔ)存?zhèn)溆茫粚?duì)于含耐高溫有效成分（如：肝素）的腸粘膜，可在沸水蒸煮處理，烘干后長(zhǎng)期保存。 冰箱的除霜循環(huán)，可能對(duì)細(xì)胞造成傷害，要特別小心。解凍時(shí)要越快越好，但避免局部過熱。,2.植物材料： 選材：注意植物品種和生長(zhǎng)發(fā)育狀況不同，其中所含生物大分子的量變化很大，另外與季節(jié)性關(guān)系密切。種子須泡脹或粉碎才可使用。含油脂較多的也要進(jìn)行脫脂處理。 a.提取核DNA：選用黃化苗（生長(zhǎng)710天小麥，水稻），防止葉綠體DNA

9、的干擾。 b.提取RNA：根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x用生長(zhǎng)幼嫩組織為好。 保存：冷凍采樣后盡快放于-4-20冰箱內(nèi)。 DNA,RNA 采樣后，液氮速凍，至-70冰箱。對(duì)RNA樣品，如不立即使用，冷凍保存尤為重要。,3.微生物： 選材：應(yīng)注意它的生長(zhǎng)期，在微生物的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，酶和核酸的含量較高，可以獲得高產(chǎn)量，以微生物為材料時(shí)有兩種情況： a.利用微生物菌體分泌到培養(yǎng)基中的代謝產(chǎn)物和胞外酶等。一般用離心法收集上清液，上清液只能在低溫下短期保存 b.利用菌體含有的生化物質(zhì)，如：蛋白質(zhì)，核酸和胞內(nèi)酶等。需破碎菌體細(xì)胞分離，濕菌體可低溫短期保存，凍干粉可在4保存數(shù)月。,二、細(xì)胞的破碎 1. 機(jī)械破碎： (1) 研

10、磨法 剪碎的動(dòng)物組織如鼠肝、兔肝等置研缽中，用研磨棒研碎。為了提高研磨效果，可加入一定量的石英砂。用勻漿器處理，也能破碎動(dòng)物細(xì)胞。此法較溫和，適宜實(shí)驗(yàn)室使用。但加石英砂時(shí)，要注意其對(duì)有效成分的吸附作用。如系大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)，可用電動(dòng)研磨法。細(xì)菌和植物組織的細(xì)胞破碎均可用此法。,(2) 組織搗碎器法 用搗碎器(轉(zhuǎn)速8000-10000r/m)處理30-45s可將植物和動(dòng)物細(xì)胞完全破碎。如用其破碎酵母菌和細(xì)菌的細(xì)胞時(shí)，須加入石英砂才有效。但是在搗碎期間必須保持低溫，搗碎的時(shí)間不易太長(zhǎng)，以防溫度升高引起有效成分變性?，F(xiàn)在多用細(xì)胞破碎儀。 (3) 超聲波法 借助聲波的震動(dòng)力破碎細(xì)胞壁和細(xì)胞器的有效方法。多

11、用于微生物細(xì)胞的破碎，一般輸出功率100-200W，破碎時(shí)間315min。如果在細(xì)胞懸浮液中加石英砂則可縮短時(shí)間。為了防止電器長(zhǎng)時(shí)間運(yùn)轉(zhuǎn)產(chǎn)生過多的熱量，常采用間歇處理和降低溫度的方法進(jìn)行。,(4) 壓榨法 是一種溫和、徹底破碎細(xì)胞的方法。用30MPa左右的壓力迫使幾十毫升細(xì)胞懸液通過一個(gè)小孔(細(xì)胞直徑的孔)，致使其被擠破 、壓碎。 (5) 凍融法 將細(xì)胞置低溫下冰凍一定時(shí)間，然后取出置室溫下(或40左右)迅速融化。如此反復(fù)凍融多次，細(xì)胞可在形成冰粒和增高剩余胞液鹽濃度的同時(shí)，發(fā)生溶脹、破碎。,2.溶漲和自溶 溶漲：細(xì)胞膜為天然的半透膜，在低滲溶液如低濃度的稀鹽溶液中，由于存在滲透壓差，溶劑分子

12、大量進(jìn)入細(xì)胞，引起細(xì)胞膜發(fā)生脹破的現(xiàn)象稱溶脹。例如紅血球置清水中會(huì)迅速溶脹破裂并釋放出血紅素。 自溶：細(xì)胞結(jié)構(gòu)在本身所具有的各種水解酶如蛋白酶和酯酶等作用下，發(fā)生溶解的現(xiàn)象稱自溶。 應(yīng)用此法時(shí)要特別小心操作，因?yàn)樗饷覆粌H可使細(xì)胞壁、細(xì)胞膜破壞，同時(shí)也可將某些有效成分在自溶時(shí)分解。 3.化學(xué)處理 用脂溶性的溶劑(如丙酮、氯仿、甲苯)或表面活性劑(如十二烷基磺酸鈉、十二烷基硫酸鈉) 處理細(xì)胞時(shí)，可將細(xì)胞壁、細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)部分溶解，進(jìn)而使細(xì)胞釋放出各種酶類或DNA等物質(zhì)，并導(dǎo)致整個(gè)細(xì)胞破碎。,4. 生物酶降解 生物酶(如溶菌酶)有降解細(xì)菌細(xì)胞壁的功能。在用此法處理細(xì)菌細(xì)胞時(shí)，先是細(xì)胞壁消解，隨之而來

13、的是因滲透壓差引起的細(xì)胞膜破裂，最后導(dǎo)致細(xì)胞完全破碎。 例如從某些細(xì)菌細(xì)胞提取質(zhì)粒DNA時(shí)，不少方法都采用了加溶菌酶(來自蛋清)破壞細(xì)胞壁的步驟。當(dāng)有些細(xì)菌對(duì)溶菌酶不敏感時(shí)，可加巰基乙醇（ME）或者8mol/L的尿素，以促進(jìn)細(xì)胞壁的消化。另外，也可加入蛋白酶K來提高破壁效果。 而在破壞酵母菌的細(xì)胞時(shí)，可采用螺旋酶進(jìn)行。一般對(duì)數(shù)期的酵母細(xì)胞對(duì)該酶較敏感。將酵母細(xì)胞懸于0.1mol/L檸檬酸/磷酸氫二鈉緩沖液(pH5.4)中，加入1%螺旋酶， 在30處理30分鐘，即可使大部分細(xì)胞壁破裂，如同時(shí)加入0.2%巰基乙醇效果更好。,三、抽提 1.抽提的含義 抽提通常是指用適當(dāng)?shù)娜軇┖头椒◤脑牧现邪延行С?/p>

14、分分離出來的過程。 經(jīng)過處理的原材料中的有效成分可用緩沖液、稀酸、稀堿、或有機(jī)溶劑（如丙酮、乙醇）等抽提，有時(shí)還可用蒸餾水抽提。 一般理想的抽提液應(yīng)具備下述條件：對(duì)有效成分溶解度大，破壞作用??；對(duì)雜質(zhì)不溶解或溶解度很??；來源廣泛、價(jià)格低廉、操作安全等。,2.抽提的影響因素 在抽提階段，pH值、金屬離子、溶劑的濃度和極性等因素，可明顯影響有效成分的性質(zhì)和數(shù)量。因此選擇抽提液必須考慮這些因素。 （1）pH值 改變?nèi)苜|(zhì)解離狀態(tài)。 對(duì)蛋白質(zhì)或酶等具有等電點(diǎn)的兩性電解質(zhì)物質(zhì)，一般選擇抽提液的pH值應(yīng)在偏離等電點(diǎn)的穩(wěn)定范圍內(nèi)。通常堿性蛋白質(zhì)選用低pH值的溶液抽提，酸性蛋白質(zhì)選用高pH值的溶液抽提，或者用調(diào)

15、至一定pH值的有機(jī)溶劑抽提。 注意：當(dāng)用酸，堿控制溶液pH值時(shí)，要邊加邊攪，防止局部出現(xiàn)過高的酸，堿濃度造成蛋白質(zhì)變性。,(2)溶劑的極性和離子強(qiáng)度 有些生物大分子在極性大、離子強(qiáng)度高的溶液中穩(wěn)定；有些則在極性小、離子強(qiáng)度低的溶液中穩(wěn)定。例如提取刀豆球蛋白A時(shí)，用0.15mol/L甚至更高濃度的NaCl溶液，都可使其從刀豆粉中溶解出來，穩(wěn)定存在。而抽提脾磷酸二酯酶時(shí)，則需用0.2 mol/L蔗糖水溶液。 一種物質(zhì)溶解度大小與溶劑性質(zhì)密切相關(guān)（相似相溶原理）；離子強(qiáng)度通過影響溶質(zhì)的帶電性也影響溶質(zhì)的溶解度。 降低極性：在水溶液中加蔗糖，甘油，二甲亞砜，二甲基甲酰氨。,提高離子強(qiáng)度：在水溶液中加中

16、性鹽（KCl, NaCl, NH4Cl, (NH4)2SO4） 一般離子強(qiáng)度較低的中性鹽溶液可促進(jìn)蛋白溶解（鹽溶），高離子強(qiáng)度的中性鹽可引起蛋白質(zhì)沉淀，析出（鹽析）。 高離子強(qiáng)度使DNA溶解度增加；低離子強(qiáng)度使RNA溶解度增加（核酸分離依據(jù)）。 常用的鹽溶液是NaCl溶液，濃度以0.15mol/L為宜。但是在提取核蛋白或細(xì)胞器中的蛋白質(zhì)時(shí)，為促使蛋白質(zhì)與核酸、蛋白質(zhì)與細(xì)胞器分離，則宜用高濃度(0.5-2.0mol/L)的鹽溶液。,(3)水解酶 細(xì)胞破裂后，許多水解酶釋放出來。水解酶與欲抽提的蛋白質(zhì)或核酸接觸時(shí)，一旦條件適宜，就會(huì)發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)或核酸分解，而使實(shí)驗(yàn)失敗。為此，必須采用加入抑

17、制劑，調(diào)節(jié)抽提液的pH、離子濃度或極性等方法，使這些酶喪失活性。 如：提取，純化胰島素時(shí)，為阻止胰蛋白酶活化，采用68的乙醇溶液（pH2.5-3.0,用草酸調(diào)節(jié)），在1315抽提3h，可得到較高的回收率。因?yàn)?8乙醇可使胰蛋白酶暫時(shí)失活，草酸可除去蛋白酶的激活劑Ca2+，酸性環(huán)境也抑制酶蛋白活性。 RNA提取需防止RNase的水解作用，RNase活性很高，很容易使RNA降解，所以每一步都嚴(yán)格控制RNase，可采用DEPC（焦碳酸二乙脂）處理，帶手套操作，提取液中加強(qiáng)的變性劑異硫氰酸胍等措施。,(4)溫度 一般認(rèn)為蛋白質(zhì)或酶制品在低溫(如0左右)時(shí)最穩(wěn)定。 例如：在生產(chǎn)人絨毛膜促性腺激素(HCG

18、，糖蛋白)制品時(shí)，一定要在低溫下進(jìn)行。當(dāng)溫度低于8時(shí)， 從200公斤孕婦尿中可提取約100克HCG粗品(活力為160u/mg)；當(dāng)溫度高于20時(shí)，從400公斤孕婦尿中都提取不到100克粗品，而且活力很低。此外，高溫下制備的HCG粗品很難進(jìn)一步純化至3500u/mg，原因是高溫會(huì)使HCG受到微生物和/或糖苷酶的破壞。,一般提高溫度，溶解度增加，但易使大分子物質(zhì)變性失活。 小分子物質(zhì)：5070；生物大分子：010，最好控制在04,（5）攪拌 攪拌能促使欲抽提物與抽提液的接觸，并能增加溶解度。但是，一般宜采用溫和的攪拌方法 ，速度太快時(shí)容易產(chǎn)生泡沫，導(dǎo)致某些酶類變性失活。 （6）氧化 一般蛋白質(zhì)都含

19、相當(dāng)數(shù)量的巰基，該基團(tuán)常常是酶和蛋白質(zhì)的必須基團(tuán)，若抽提液中存在氧化劑或氧分子時(shí)，會(huì)使巰基形成分子內(nèi)或分子間的二硫鍵，導(dǎo)致酶(或蛋白質(zhì))失活(或變性)。在提取液中加入巰基乙醇，半胱氨酸。還原性谷胱甘肽等還原劑，可防止巰基發(fā)生氧化，使蛋白，酶失活。,（7）金屬離子 蛋白質(zhì)的巰基除易受氧化劑作用外，還能和金屬離子如鉛、鐵或銅作用，產(chǎn)生沉淀復(fù)合物。 這些金屬離子主要來源于制備緩沖液的試劑中。解決的辦法：用無離子水或重蒸水配制試劑；在配制的試劑中加入1-3mmol/L的EDTA(金屬離子絡(luò)合劑)。 （8）抽提液與抽提物的比例 在抽提時(shí)，抽提液與抽提物的比例要適當(dāng)，一般以51為宜。如抽提液過多，則有利于

20、有效成分的提取，但不利于純化工序的進(jìn)行。,Copyright 2010 by Ouyang Hongsheng. All rights reserved.,第二章 沉淀技術(shù),郝林琳 動(dòng)物生物技術(shù)系 吉林大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院 Tel概念 沉淀是溶液中的溶質(zhì)由液相變成固相析出的過程。 意義 沉淀法（即溶解度法）操作簡(jiǎn)便，成本低廉，不僅用于實(shí)驗(yàn)室中，也用于某些生產(chǎn)目的的制備過程，是分離純化生物大分子，特別是制備蛋白質(zhì)和酶時(shí)最常用的方法。通過沉淀，將目的生物大分子轉(zhuǎn)入固相沉淀或留在液相，而與雜質(zhì)得到初步的分離。 基本原理 根據(jù)不同物質(zhì)在溶劑中的溶解度不同而達(dá)到分離的目的，不同

21、溶解度的產(chǎn)生是由于溶質(zhì)分子之間及溶質(zhì)與溶劑分子之間親和力的差異而引起的，溶解度的大小與溶質(zhì)和溶劑的化學(xué)性質(zhì)及結(jié)構(gòu)有關(guān)，溶劑組分的改變或加入某些沉淀劑以及改變?nèi)芤旱膒H值、離子強(qiáng)度和極性都會(huì)使溶質(zhì)的溶解度產(chǎn)生明顯的改變。,第一節(jié) 蛋白質(zhì)的沉淀分離,一、鹽析 1.鹽析的原理 定義 一般在低鹽濃度的情況下，蛋白質(zhì)的溶解度隨鹽濃度的升高而增加，這種現(xiàn)象稱為鹽溶；而當(dāng)鹽濃度升高到一定程度后，蛋白質(zhì)的溶解度又隨著鹽濃度的升高而降低，結(jié)果使蛋白質(zhì)沉淀析出，這種現(xiàn)象稱為鹽析作用。在同一濃度的鹽溶液中，不同蛋白質(zhì)的溶解度不同，借此可達(dá)到彼此分離的目的。 原理 鹽濃度增高到一定數(shù)值后，水活性降低，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子表

22、面電荷逐漸被中和，水化膜相繼被破壞，最終引起蛋白質(zhì)分子間相互聚集并從溶液中析出。,鹽能夠改變蛋白質(zhì)的溶解度，蛋白質(zhì)的溶解度與溶液中離子強(qiáng)度有密切關(guān)系。兩者的關(guān)系可用下式表示： lg（S/S0 ）= -KsI S為蛋白質(zhì)在離子強(qiáng)度為I時(shí)的溶解度(g/L)；S0為蛋白質(zhì)在離子強(qiáng)度為0時(shí)的溶解度；Ks為鹽析常數(shù)；I為離子強(qiáng)度。,在溫度一定的條件下，某一蛋白質(zhì)在某一pH值的水溶液中的溶解度為一常數(shù)S0。故上式可 改寫為： lgS = lgS0 KsI = KsI =lgS0為一常數(shù) 值主要取決于蛋白質(zhì)的性質(zhì)，也與溶液的溫度和pH值有關(guān) ；鹽析常數(shù)Ks主要與鹽的性質(zhì)(離子價(jià)數(shù)、平均半徑等)和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)

23、有關(guān)，Ks越大， 鹽析效果越好。,所以對(duì)某一蛋白質(zhì)來說，在溫度和pH值等鹽析條件確定(即確定)，所采用的鹽確定(即Ks確定)以后，蛋白質(zhì)的溶解度決定于離子強(qiáng)度I,I可用下式計(jì)算： I = 1/2 miZi2 mi:溶液中離子的摩爾濃度 Zi：離子的價(jià)數(shù) 對(duì)于多種蛋白質(zhì)或酶的混合液，可采用分段鹽析法進(jìn)行分離純化。,2.鹽的選擇： 蛋白質(zhì)的鹽析通常采用中性鹽，如硫酸銨、硫酸鈉、硫酸鎂、氯化鈉、磷酸鈉等，其中應(yīng)用最廣的是硫酸銨。 硫酸銨是一中性鹽，對(duì)蛋白質(zhì)有相當(dāng)好的穩(wěn)定作用。又因?yàn)槠潆x子容積較大，吸走水分子的能力也大，成為有效的鹽析工具。 硫酸銨在水中的溶解度大而受溫度影響小(溫度系數(shù)小)( 25時(shí)

24、溶解度為4.1mol/L，即767g/L;0時(shí)溶解度為3.7mol/L，即697g/L)，而且價(jià)廉易得，不易引起蛋白質(zhì)變性，分離效果比其他鹽好。 但是用硫酸銨鹽析時(shí)，緩沖能力較差，而且銨離子會(huì)干擾蛋白氮的測(cè)定，故有時(shí)也要用其他鹽來進(jìn)行鹽析。磷酸鉀和硫酸鈉的鹽析系數(shù)Ks較大，但由于在較低溫度下的溶解度太低,受溫度影響大，故應(yīng)用不廣泛。,09年全國碩士研究生入學(xué)考試農(nóng)學(xué)聯(lián)考生化題 酶純化實(shí)驗(yàn)中,通常先用(NH4)2SO4作為分級(jí)沉淀劑,再用Sephadex G-25凝膠柱層析法從沉淀酶液中除去(NH4)2SO4。請(qǐng)問： (1)與其他中性鹽沉淀劑相比，用(NH4)2SO4做沉淀劑有何優(yōu)點(diǎn)？ (2)如

25、發(fā)現(xiàn)柱層析后酶的總活性較純化前明顯升高，可能的原因是什么？ (3)柱層析時(shí)，濕法裝柱的注意事項(xiàng)主要有哪些？ 答:(1)硫酸銨具有溶解度大、溫度系數(shù)小、對(duì)酶活力影響小和利于分離等優(yōu)點(diǎn)。(2)純化前酶液中可能含有酶抑制劑。(3)注意事項(xiàng)：層析柱應(yīng)與水平面垂直；柱床體積至少是上樣體積的3倍以上；層析介質(zhì)中不能出現(xiàn)氣泡和斷層；柱床表面要平整，并保有一定的水位。,3.硫酸銨濃度的計(jì)算與調(diào)整方法 通常硫酸銨的添加以百分飽和度來表示 (不是濃度百分比)，例如大部分蛋白質(zhì)可在 80% 硫酸銨飽和度下沉淀。因?yàn)榱蛩徜@加入的體積很大，會(huì)改變最后的總體積，很難由濃度百分比來計(jì)算，因此使用百分飽和度作為沉淀蛋白質(zhì)的度

26、量。 用硫酸銨進(jìn)行鹽析時(shí)，蛋白質(zhì)溶液中硫酸銨濃度的調(diào)整方法主要有二種 ： (1)加入飽和溶液法 (2)加入固體鹽法,(1)加入飽和溶液法 要求：蛋白質(zhì)溶液體積不大，所需調(diào)整的硫酸銨濃度不高 V= V0(S2-S1)/（1-S2） V:所需加進(jìn)的飽和硫酸銨溶液的體積；V0:原溶液體積；S2：所需達(dá)到的硫酸銨飽和度；S1:原溶液的硫酸銨飽和度。 飽和硫酸銨的配制方法：在一定量的水中加入過量的硫酸銨，加熱至5060，趁熱濾去沉淀，再在0或室溫平衡12天，有固體析出時(shí)達(dá)100飽和度。,(2)加入固體鹽法 要求：飽和度高，不增大溶液體積 t=G(S2-S1)/（1-AS2） S2，S1:分別代表所需達(dá)到

27、的硫酸銨飽和度和原溶液的硫酸銨飽和度；t：將1L S1飽和度的溶液提高到S2飽和度時(shí)所需加進(jìn)的硫酸銨克數(shù)；G,A：常數(shù)，與溫度有關(guān)。 實(shí)際使用時(shí)，t可直接查表得到。（注意：0，25兩張表，室溫用25）,4.影響蛋白質(zhì)鹽析的因素 （1）蛋白質(zhì)濃度 蛋白質(zhì)濃度高時(shí)，欲分離的蛋白質(zhì)常常夾雜著其他蛋白質(zhì)一起沉淀出來（共沉現(xiàn)象）。因此在鹽析前要加等量生理鹽水稀釋，使蛋白質(zhì)含量在25-30g/L。 （2）離子強(qiáng)度和離子類型的影響 a.離子強(qiáng)度增加，溶解度下降，鹽析易發(fā)生 b.不同蛋白質(zhì)鹽析時(shí)所需離子強(qiáng)度不同，可采用分步鹽析，通過逐步增加離子強(qiáng)度，使不同蛋白分步沉淀出來 c.離子強(qiáng)度相同時(shí)，高價(jià)離子，半徑小

28、的離子鹽析力強(qiáng),（3）pH的影響 大多數(shù)蛋白質(zhì)在等點(diǎn)電時(shí)，在鹽溶液中的溶解度最低。所以鹽析時(shí)溶液pH值調(diào)到等電點(diǎn)效果最好。 （4）溫度的影響 a.在低離子強(qiáng)度或純水中，溫度升高，溶解度增加； b.在高鹽溶液中，溫度升高，溶解度降低。 一般在室溫下進(jìn)行鹽析;溫度敏感的蛋白質(zhì)在低溫4進(jìn)行;也有個(gè)別酶在低溫時(shí)失活，高溫有活性,如血紅蛋白、肌紅蛋白、清蛋白在25比0時(shí)溶解度低，更容易鹽析。,實(shí)際使用 制備初期：pH ，溫度一定，改變鹽濃度（離子強(qiáng)度）（Ks分段鹽析）； 純化，結(jié)晶：離子強(qiáng)度一定，改變pH，溫度（分段鹽析）,5.鹽析時(shí)的注意事項(xiàng) （1）添加的硫酸銨的純度要高，添加后，要放30min以上使

29、其充分溶解，且要不斷攪拌，防止局部過濃，發(fā)生共沉淀； （2）同一溶液中欲分離幾種蛋白質(zhì)時(shí)，可采用分段鹽析的方法。鹽析通常與等電點(diǎn)沉淀法配合使用。 （3）選擇好溫度，一般在室溫下進(jìn)行； （4）蛋白濃度不易過高，一般2530g/L；低濃度鹽析，可用離心分離；高濃度鹽析（7080），用過濾（因?yàn)檎扯却螅x心操作慢）；鹽析沉淀得到的蛋白質(zhì)含量較高，純品需經(jīng)脫鹽處理，如透析，凝膠過濾等。,二、等電點(diǎn)沉淀 利用蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)溶解度最低以及不同的蛋白質(zhì)具有不同等電點(diǎn)一這特性，對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分離純化的方法稱為等電點(diǎn)沉淀法。 在等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)分子的凈電荷為零，消除了分子間的靜電斥力，但由于水膜的存在，蛋白質(zhì)仍

30、有一定的溶解度而沉淀不完全，所以等電沉淀法經(jīng)常與鹽析法或有機(jī)溶劑沉淀法聯(lián)合使用。,二、等電點(diǎn)沉淀 單獨(dú)使用等電點(diǎn)法主要是用于去除等電點(diǎn)相距較大的雜蛋白。在加酸或加堿調(diào)節(jié)pH的過程中，要一邊攪拌一邊慢慢加入，以防止局部過酸或過堿 。,三、有機(jī)溶劑沉淀法 作用機(jī)理： （1）降低水溶液的介電常數(shù)，使溶質(zhì)溶解度降低； （2）破壞大分子周圍水膜，使溶解度降低。 利用不同蛋白質(zhì)在不同濃度的有機(jī)溶劑中的溶解度不同而使蛋白質(zhì)分離的方法，稱為有機(jī)溶劑沉淀法。經(jīng)常使用的有機(jī)溶劑是乙醇和丙酮。,三、有機(jī)溶劑沉淀法 優(yōu)點(diǎn)： 比鹽析法析出的沉淀容易過濾或離心分離，分辨力比鹽析法好，溶劑也容易除去。,缺點(diǎn)： 有機(jī)溶劑沉淀

31、法易使蛋白質(zhì)和酶變性，所以操作必須在低溫條件下進(jìn)行。蛋白質(zhì)和酶沉淀分離后，應(yīng)立即用水或緩沖液溶解，以降低有機(jī)溶劑濃度，避免變性。 中性鹽可減少有機(jī)溶劑引起的蛋白質(zhì)變性，提高分離效果，一般添加0.05mol/L的中性鹽。 由于中性鹽會(huì)增加蛋白質(zhì)在有機(jī)溶劑中的溶解度，故中性鹽不宜添加太多。,有機(jī)溶劑沉淀法一般與等電點(diǎn)沉淀法聯(lián)合使用。即操作時(shí)溶液的pH值應(yīng)控制在欲分離蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)附近。,注意： （1) 低溫操作 （2）樣品濃度過大，易變性，共沉淀作用大，分離效果差；過小，易產(chǎn)生變性，回收率低。 （3）樣品穩(wěn)定結(jié)構(gòu)范圍內(nèi)，選擇溶解度最低處的pH，即與等電點(diǎn)共沉淀結(jié)合使用。 （4) 注意離子強(qiáng)度，離子

32、種類的影響。,四、選擇性變性沉淀 選擇一定的條件使溶液中存在的某些雜蛋白變性沉淀而不影響所需蛋白質(zhì)的方法稱為選擇性變性沉淀法。 例如：利用加熱，改變pH或加進(jìn)某些重金屬離子等使雜蛋白變性沉淀而除去。應(yīng)用此法，應(yīng)對(duì)欲提純蛋白質(zhì)和雜蛋白的理化性質(zhì)有較全面的了解。,五、非離子多聚物沉淀法 聚乙二醇（PEG），葡聚糖，右旋糖苷硫酸鈉等非離子多聚物可以沉淀蛋白質(zhì)和細(xì)菌。 沉淀機(jī)理 空間位置排斥效應(yīng)。試劑溶解度大，在水中占據(jù)大部分空間，將需沉淀物相互靠近，增加碰撞機(jī)率。 優(yōu)點(diǎn) （1）操作條件溫和，不易引起變性； （2）具有極高的沉淀效率； （3）沉淀后多聚物容易除去。 應(yīng)用 沉淀分離細(xì)菌，病毒蛋白；質(zhì)粒純

33、化（做洋蔥表皮瞬時(shí)表達(dá)）。,第二節(jié) 核酸的提取與沉淀分離,核酸類化合物都溶于水而不溶于有機(jī)溶劑。所以核酸可用水溶液提取，而用有機(jī)溶劑沉淀法沉淀分離。 從生物材料中分離出的DNA和RNA，往往是以DNA-蛋白質(zhì)（DNP）或RNA-蛋白質(zhì)（RNP）復(fù)合物形式存在 。因此，要制備初步純化的核酸時(shí)，首先要分離出DNP或RNP，再將復(fù)合物解聚，除去蛋白質(zhì)，然后通過沉淀法得到核酸。DNP 在0.14mol/L的氯化鈉溶液中， RNP 的溶解度相當(dāng)大，而DNP的溶解度僅為在水中溶解度的1%； 當(dāng)氯化鈉的濃度達(dá)到1mol/L的時(shí)候， RNP的溶解度小，而DNP的溶解度比在水中的溶解度大2倍。 所以常選用0.1

34、4mol/L的氯化鈉溶液提取RNP，而選用1mol/L的氯化鈉溶液提取DNP。,DNP,1.DNP/RNP復(fù)合物的解聚： 主要采用加入去污劑、有機(jī)溶劑和蛋白水解酶等試劑來實(shí)現(xiàn)。 去污劑 在破碎細(xì)胞的溶液中，加入適量的陰離子去污劑SDS、Triton X-100、Tween 40 和 NP-40 等，有利于膜蛋白和脂肪溶解，將DNP/RNP復(fù)合物解聚，進(jìn)而釋放出核酸。 有機(jī)溶劑 苯酚、氯仿等是蛋白質(zhì)的變性劑。根據(jù)抽提液中蛋白質(zhì)的含量和溶劑的純度，用變性劑反復(fù)處理抽提液，直到離心后，上層水相（含核酸）和下層有機(jī)相之間的界面處無變性蛋白為止。 蛋白水解酶 本法較溫和，常用的水解酶有蛋白酶K和蛋白酶E

35、，可以避免剪切和破壞核酸。,2.多糖的消除： 采用動(dòng)物或植物作材料提取核酸時(shí)，動(dòng)物在宰殺前饑餓12h，植物在取材前暗室培養(yǎng)數(shù)天，其體內(nèi)的糖原和淀粉類物質(zhì)均會(huì)減少。 混雜于核酸提取液中的多糖類物質(zhì)，一般可用選擇性沉淀劑如異丙醇、十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）可達(dá)到分離目的。 或用等體積的2.5mol/L磷酸緩沖液和等體積的乙二醇甲醚處理，離心后，多糖位于中部，核酸存在上層乙二醇甲醚中。,3.RNA的提?。?tRNA(約占細(xì)胞內(nèi)RNA的15%)的相對(duì)分子質(zhì)量較小，在細(xì)胞破碎以后溶解在水溶液中，濾液用酸處理，調(diào)節(jié)到pH5得到的沉淀的中可分離得到tRNA。 mRNA占細(xì)胞RNA的5%左右，很不穩(wěn)定，

36、提取條件要嚴(yán)格控制。 rRNA約占細(xì)胞內(nèi)RNA的80%，一般提取的RNA主要是rRNA。 RNA的提取方法主要有稀鹽溶液提取和苯酚溶液提取。,稀鹽溶液提取 將細(xì)胞破碎制成細(xì)胞勻漿，然后用0.14mol/L的氯化鈉溶液反復(fù)抽提，得到核糖核蛋白提取液，再進(jìn)一步與脫氧核糖核蛋白、蛋白質(zhì)、多糖等分離，可得RNA。 苯酚溶液提取 在細(xì)胞破碎制成勻漿后，用SDS變性蛋白并抑制RNase活性，經(jīng)多次酚/氯仿在一定條件下振蕩一定時(shí)間，抽提除去蛋白、多糖、色素等后，用NaAc和乙醇沉淀RNA，將RNA與蛋白質(zhì)分開。,4.DNA的提取 從細(xì)胞中提取DNA，一般在細(xì)胞破碎后用濃鹽法提取。即用1mol/L的氯化鈉溶液

37、從細(xì)胞勻漿中提取脫氧核糖核蛋白，再與含有少量辛醇或戊醇的氯仿一起振蕩除去蛋白質(zhì)。或者先以0.14mol/L氯化鈉溶液(也可用0.1mol/L NaCl加上0.05mol/L檸檬酸代替)反復(fù)洗滌除去核糖核蛋白后，再用1mol/L氯化鈉溶液提取脫氧核糖核蛋白，經(jīng)氯仿戊醇(辛醇)或水飽和酚處理 ，除去蛋白質(zhì)，而得到DNA。,5. 核酸的沉淀分離 核酸分離純化應(yīng)維持在0-4的低溫度條件下，以防止核酸的變性和降解。為防止核酸酶引起的水解作用，可加入十二烷基硫酸鈉(SDS)、乙二胺四乙酸(EDTA)、8-羥基喹啉、檸檬酸鈉等以抑制核酸酶的活性。 常用的沉淀分離法有： (1)有機(jī)溶劑沉淀法 (2)等電點(diǎn)沉淀

38、法 (3)鈣鹽沉淀法 (4)選擇性溶劑沉淀法,（1）有機(jī)溶劑沉淀法 由于核酸都不溶于有機(jī)溶劑，所以可在核酸提取液中加入乙醇、異丙醇或2-乙氧基乙醇，使DNA或RNA沉淀下來。 核酸沉淀的形狀與其相對(duì)分子質(zhì)量密切相關(guān)，相對(duì)分子質(zhì)量106Da的雙鏈DNA可以絲狀纖維纏繞在玻棒上；相對(duì)分子質(zhì)量稍小的雙鏈DNA或單鏈DNA、RNA則以凝膠形式存在，這些核酸經(jīng)離心后存在于沉淀中，用70%乙醇洗滌，除去其它鹽和小分子物質(zhì)，干燥后即為核酸制品。,(2) 等電點(diǎn)沉淀法 脫氧核糖核蛋白的等電點(diǎn)為pH4.2；核糖核蛋白的等電點(diǎn)力pH2.0-2.5；tRNA的等電點(diǎn)為pH5。所以將核酸提取液調(diào)節(jié)到一定的pH，就可使

39、不同的核酸或核蛋白分別沉淀而分離。,(3) 鈣鹽沉淀法 在核酸提取液中加入一定體積比(一般為1/10)的10%氯化鈣溶液，使DNA和 RNA均成為鈣鹽形式，再加進(jìn)1/5體積的乙醇，DNA鈣鹽即形成沉淀析出。,(4) 選擇性溶劑沉淀法 選擇適宜的溶劑，使蛋白質(zhì)等雜質(zhì)形成沉淀而與核酸分離，這種方法稱為選擇性溶劑沉淀法 。 在核酸提取液中加入氯仿/異戊醇或氯仿/辛醇，振蕩一段時(shí)間，使蛋白質(zhì)在氯仿/水界面上形成凝膠狀沉淀而離心除去，核酸仍留在水溶液中。 在對(duì)氨基水楊酸等陰離子化合物存在下，核酸的苯酚水溶液提取液中，DNA和RNA都進(jìn)入水層，而蛋白質(zhì)沉淀于苯酚層中被分離除去。 在DNA與RNA的混合液中

40、，用異丙醇選擇性地沉淀DNA而與留在溶液中的RNA分離。,Copyright 2010 by Ouyang Hongsheng. All rights reserved.,第三章 膜分離技術(shù),歐陽紅生 動(dòng)物生物技術(shù)系 吉林大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院 Email: Tel概念 用人工合成的某種材料作為兩相之間的不連續(xù)區(qū)間實(shí)現(xiàn)不同物質(zhì)分離的技術(shù)叫膜分離。 基本原理 膜的作用是分隔兩相界面，并以特定的形式限制和傳遞各種化學(xué)物質(zhì)。它可以是均相的或非均相的，對(duì)稱型的或非對(duì)稱型的。中性的或荷電性的，固體的或液體的，其厚度可以從幾微米到幾毫米。 特點(diǎn) 膜分離操作簡(jiǎn)單、效率較高，沒有相變，

41、節(jié)省能耗，特別適合處理熱敏性物質(zhì)。,第三章 膜分離技術(shù),第一節(jié) 透析,透析(dialysis)借助半透膜相隔的兩相液體,利用具有不同截留相對(duì)分子質(zhì)量的半透膜,使高滲溶液中的小分子穿過半透膜進(jìn)入低滲溶液一側(cè),生物大分子被載留在膜的高滲溶液一側(cè),從而將小分子與生物大分子分開的一種分離純化技術(shù).如把待純化的蛋白質(zhì)溶液裝在半透膜的透析袋里，放入透析液（蒸餾水或緩沖液）中進(jìn)行透析，透析液可以更換，直至透析袋內(nèi)無機(jī)鹽等小分子物質(zhì)降到最小值為止。,第一節(jié) 透析,透析(dialysis) 原理 透析的動(dòng)力是擴(kuò)散壓，擴(kuò)散壓是由橫跨膜兩邊的濃度梯度形成的。透析的速度反比于膜的厚度，正比于欲透析的小分子溶質(zhì)在膜內(nèi)外

42、兩邊的濃度梯度，還正比于膜的面積和溫度，通常是4透析，升高溫度可加快透析速度。 透析的應(yīng)用 利用蛋白質(zhì)分子不能通過半透膜的性質(zhì)，使蛋白質(zhì)和其他小分子物質(zhì)如無機(jī)鹽、單糖等分開。,影響透析速度的因素： （1）半透膜的通透性：市面上有商品化的不同型號(hào)的透析膜，透析管；常用的半透膜是玻璃紙或賽璐玢紙、火綿紙或稱賽璐琔紙和其他改型的纖維素材料。但用的最多的還是用纖維素制成的透析膜，目前常用的是美國Union Carbide （聯(lián)合碳化物公司）和美國光譜醫(yī)學(xué)公司生產(chǎn)的各種尺寸的透析管，截留分子量MwCO（即留在透析袋內(nèi)的生物大分子的最小分子量，縮寫為MwCO）通常為1萬左右。,影響透析速度的因素： （1）

43、半透膜的通透性： （2）透析外液的更換：反復(fù)更換透析外液，增加透析速度；對(duì)流水透析，可進(jìn)行初期透析；攪拌，使梯度差變得均勻，可增加透析速度。 （3）溫度：溫度增加，則透析速度增加，但要注意生物活性。 （4）壓力：增加壓力可加快透析速度，如真空透析。,透析袋的使用： 商品透析袋制成管狀，其扁平寬度為23 mm50 mm不等。為防干裂，出廠時(shí)都用10的甘油處理過，并含有極微量的硫化物、重金屬和一些具有紫外吸收的雜質(zhì)，它們對(duì)蛋白質(zhì)和其它生物活性物質(zhì)有害，用前必須除去。可先用50乙醇煮沸1小時(shí)，再依次用50乙醇、0.01 mol/L碳酸氫鈉和0.001 mol/L EDTA溶液洗滌，最后用蒸餾水沖洗即

44、可使用。實(shí)驗(yàn)證明，50乙醇處理對(duì)除去具有紫外吸收的雜質(zhì)特別有效。 使用后的透析袋洗凈后可存于4蒸餾水中，若長(zhǎng)時(shí)間不用，可加少量NaN2，以防長(zhǎng)菌。洗凈涼干的透析袋彎折時(shí)易裂口，用時(shí)必須仔細(xì)檢查，不漏時(shí)方可重復(fù)使用。 新透析袋如不作如上的特殊處理，則可用沸水煮五至十分鐘，再用蒸餾水洗凈，即可使用。,透析袋的使用： 含鹽量很高的蛋白質(zhì)溶液透析過夜時(shí)，體積增加50是正常的。為了加快透析速度，除多次更換透析液外，還可使用磁子攪拌。 透析的容器要大一些，可以使用大燒杯、大量筒和塑料桶。小量體積溶液的透析，可在袋內(nèi)放一截兩頭燒園的玻璃棒或兩端封口的玻璃管，以使透析袋沉入液面以下。 檢查透析效果的方法是：用

45、1 BaCl2檢查(NH4)2SO4，用1 AgNO3 檢查NaCl、KCl等。,超濾(Ultrafiltration):利用壓力或離心力，強(qiáng)行使水和其他小分子溶質(zhì)通過一定孔徑的特制薄膜滲透到膜外,大分子被阻止在膜內(nèi),從而使大小不同的分子達(dá)到分離的目的。超濾是脫鹽、濃縮、生物大分子的分級(jí)分離常用的方法。,第二節(jié) 超濾,超濾是一種膜分離技術(shù)，它的特點(diǎn)是使用不對(duì)稱多孔膜根據(jù)分子的大小來分離溶液中的大分子物質(zhì)與小分子物質(zhì)。超濾尤其適用于大分子溶液的濃縮、不同種類分子的純化以及溶劑交換等。超濾法是一種溫和、非變性的物理方法，比其它分離方法有效率更高、更靈活的優(yōu)點(diǎn)。,第二節(jié) 超濾,原理 在外力作用下，超

46、濾膜對(duì)大分子物質(zhì)的截留主要是篩分作用，決定截留效果的主要是膜的表面活性層上孔的大小與形狀。除了篩分作用外，膜表面、微孔內(nèi)的吸附和粒子在膜孔中的滯留也使大分子被截留。 現(xiàn)在已有各種市售的超濾膜裝置可供選用，有加壓、抽濾和離心等多種形式。濾膜也有多種規(guī)格，他們截留相對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)。使用中最需注意的問題是濾膜表面容易被吸附的蛋白質(zhì)堵塞，使超濾速度減慢，被截留物質(zhì)的Mr變小。,分類 超濾根據(jù)所加的操作壓力和所用膜的平均孔徑的不同，可分為微孔過濾、超濾和反滲透三種。 微孔過濾所用的操作壓通常小于4104Pa，膜的平均孔徑為500埃14微米（1微米104埃），用于分離較大的微粒、細(xì)菌和污染物等。

47、超濾所用操作壓為4104Pa7105Pa，膜的平均孔徑為10100埃，用于分離大分子溶質(zhì)。 反滲透所用的操作壓比超濾更大，常達(dá)到35105Pa140105Pa，膜的平均孔徑最小，一般為10埃以下，用于分離小分子溶質(zhì)，如海水脫鹽，制高純水等。,超濾膜 超濾技術(shù)的關(guān)鍵是膜。 常用的膜是由乙酸纖維或硝酸纖維或此二者的混合物制成。近年來發(fā)展了非纖維型的各向異性膜，例如聚砜膜、聚砜酰胺膜和聚丙烯腈膜等。這種膜在pH 114都是穩(wěn)定的，且能在90下正常工作。超濾膜通常是比較穩(wěn)定的，能連續(xù)用12年。 超濾膜的基本性能指標(biāo)：水通量（cm3/(cm2h)）；截留率（以百分率表示）；化學(xué)物理穩(wěn)定性（包括機(jī)械強(qiáng)度）等。,超濾裝置 超濾裝置由若干超濾組件構(gòu)成。分為板框式、管式、螺旋卷式和中空纖維式四種主要類型。 由于超濾法處理的液體多數(shù)是含有水溶性生物大分子、有機(jī)膠體、多糖及微生物等。這些物質(zhì)極易粘附和沉積于膜表面上，造成嚴(yán)重的濃差極化和堵塞，這是超濾法最關(guān)鍵的問題，要克服濃差極化，通?？杉哟笠后w流量，加強(qiáng)湍流和加強(qiáng)攪拌。,超濾的主要應(yīng)用： 濃縮：使用超濾來增加所需大分子溶質(zhì)的濃度，即大分子被超濾膜截留而小分子和溶劑可自由通過，從而達(dá)到濃縮的目的。,梯度分離：按分子大小梯度分