1、第五章 高效液相色譜法,HPCL,目錄,一、概述 二、基本原理 三、裝置 四、分 類 五、在農(nóng)藥分析中的應(yīng)用,基本要求:,1.了解高效液相色譜法的發(fā)展歷程 2.掌握高效液相色譜的基本原理，柱效影響因素 3.了解高效液相色譜法的流程，熟悉高效液相色譜法裝置 4.掌握高效液相色譜法的分類 5.理解高效液相色譜法在農(nóng)藥分析中的應(yīng)用,一、概 述,以液體作流動(dòng)相，液體或固體作固定相的分離分析技術(shù)稱為液相色譜法。 經(jīng)典的柱色譜法是用碳酸鈣或氯化鋁等吸附劑填充于玻璃柱管內(nèi)，吸附劑粒徑大于l00m，柱的裝填不緊密不均勻，分離效率不高；流動(dòng)相由柱管上端依靠重力向下過(guò)柱，分離速度慢；各組分依次被淋洗下來(lái)，進(jìn)行測(cè)定

2、，效率很低，分析速度很慢。,20世紀(jì)40年代出現(xiàn)了薄層色譜法，操作方便，分析速度加快，但重復(fù)性差，難以定量。 60年代初吉丁斯(J.C.Giddings)將氣相色譜理論修正后用于液相色譜，為其現(xiàn)代化奠定了理論基礎(chǔ)。以后在技術(shù)上采用了高壓泵、高效固定相和高靈敏度檢測(cè)器，實(shí)現(xiàn)了分析速度快，分離效率高和操作自動(dòng)化；這種色譜技術(shù)稱為高效液相色譜法。,1.1 HPLC與經(jīng)典柱色譜法相比，具有以下特點(diǎn)： 1高壓 為了使流動(dòng)相能迅速地通過(guò)色譜柱，必須施加高壓 2高速 使用無(wú)脈動(dòng)的高壓泵、流動(dòng)相的流速一船為110 mlmin 3高效 使用顆粒均勻的新型細(xì)粒固定相，提高了分離效率，有時(shí)一根柱子可同時(shí)分離100種

3、以上的組分。 4高靈敏度 應(yīng)用各種高靈敏度的檢測(cè)器，可測(cè)定微量組分。使用紫外檢測(cè)器，最小檢測(cè)量可達(dá)1109g。 5高度自動(dòng)化 利用微處理機(jī)控制色譜操作條件和處理色譜數(shù)據(jù)，實(shí)現(xiàn)了高度自動(dòng)化。 6流出組分容易收集,1.2 HPLC 與GC的差別 (1) 應(yīng)用領(lǐng)域不同：在已知的化合物中，只有20可用GC測(cè)定，而HPLC可檢測(cè)的對(duì)象占有機(jī)物總數(shù)的80一85； GC局限于易揮發(fā)和熱穩(wěn)定農(nóng)藥的分離和分析；HPLC可分離和分折不揮發(fā)的、熱穩(wěn)定性差的以及離子型的農(nóng)藥。 (2) GC的分離是基于混合組分在固定液中的溶解度不同，使用的流動(dòng)相通常是惰性氣體。 GC主要是通過(guò)改變固定相和改變柱溫來(lái)改善分離效果。 HP

4、LC的流動(dòng)相為液體，它對(duì)樣本具有一定溶解性能，除了運(yùn)載樣本組分通過(guò)色譜住和進(jìn)入檢測(cè)器外，還參與色譜分離過(guò)程；在液相色譜中除通過(guò)改變固定相改善分離效果外，通常用改變流動(dòng)相組成來(lái)改善分離,(3) HPLC的柱溫受流動(dòng)相沸點(diǎn)的限制，通常在室溫或略高于室溫的條件下測(cè)定，分離時(shí)溫度較低是它的優(yōu)點(diǎn)，能保留農(nóng)藥的原來(lái)分子，可制備農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品。 (4) 農(nóng)藥分子在液體中的擴(kuò)散系數(shù)比在氣體中小45個(gè)數(shù)量級(jí)，所以在HPLC中必須特別注意柱外效應(yīng)對(duì)分離的不良影響。 (5) 液體的粘度比氣體的粘度大23個(gè)數(shù)量級(jí)，所以HPLC的柱長(zhǎng)通常不超過(guò)30cm，而GC可采用長(zhǎng)柱 (6) 液體是不可壓縮的，而氣體可被壓縮，因此在GC

5、中與載氣體積有關(guān)的參數(shù)都必須進(jìn)行校正。,二、基本原理,高效液相色譜的基本理論是在經(jīng)典液相色譜的基礎(chǔ)上，引入了氣相色譜的理論，加以改進(jìn)而發(fā)展的。 使用液相色譜的最終目的是：使樣本在最短時(shí)間內(nèi)獲得最好的分離和分析。 2.1.1 選擇性 (分離因子) 色譜柱的選擇性是衡量二個(gè)化合物能否分離的指標(biāo)，亦稱分離因子。它是兩個(gè)組分凈保留時(shí)間的比(即相對(duì)保留值)或兩個(gè)組分的平衡分配之比。,V 保留體積； t 保留時(shí)間； W 為峰寬； H 為峰高,根據(jù)圖51的兩個(gè)峰，選擇性可用下式表示： （51） t0為溶劑保留時(shí)間，t1和t2為峰1和峰2的保留時(shí)間，式中k1和k2是農(nóng)藥1和2的分配系數(shù)。 （52）,2.1.2

6、 容量因子 某一特定化合物在色譜柱上的容量因子是衡量該柱對(duì)此化合物的保留特性，化合物的凈保留時(shí)間與非滯留時(shí)間之比，根據(jù)圖51，峰1的容量因子為： （53）,2.1.3 柱 效 柱效是衡量某一特定色譜柱對(duì)化合物的譜帶展寬度和改善分離的能力，理論塔板數(shù)(N)可用下式表示： 根據(jù)上式，理論塔板數(shù)隨t成正比地增大，洗脫的譜帶寬度增加，理論塔板數(shù)下降。因半峰寬易測(cè)量準(zhǔn)確，計(jì)算的N值也比較準(zhǔn)確。 實(shí)際計(jì)算時(shí)，使用理論塔板的相當(dāng)高度HETP（或H）較方便，它也是柱效率的量度。 L為柱的長(zhǎng)度，H小則N大，即柱效高。,5-4,5-5,5-6,2.1.4 分離度 相鄰兩個(gè)峰的分離程度稱為分離度R。兩個(gè)峰尖之間距離

7、越大，分離度越大；兩峰越寬則分離度越低。分離度R按下式計(jì)算： （57） 按式(5-7)很容易比較兩化合物分離效果的好壞，但此式不能指導(dǎo)如何改進(jìn)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，以達(dá)到更有效的分離。,考慮與實(shí)驗(yàn)技術(shù)有關(guān)的參數(shù)來(lái)表示分離度，假定相鄰兩峰的峰寬相等可導(dǎo)出分離度與前述三個(gè)基本色譜參數(shù)的關(guān)系： （58） A：式中(1)項(xiàng)a是選擇性或分離因子。al，無(wú)論柱的理論塔板數(shù)有多大，分離度R等于0。 B：式中(2)項(xiàng)K是容量因子，可通過(guò)改變?nèi)軇?qiáng)度來(lái)改變。強(qiáng)溶劑出峰 時(shí)間短，導(dǎo)致小的K值，弱溶劑給出較大的K值，分離度高，但峰變寬； C：式中(3)項(xiàng)N是理論塔板數(shù)，可由改變色譜柱的長(zhǎng)度，顆粒的大小，增減流動(dòng)相的速度而變動(dòng)。

8、柱長(zhǎng)和保留時(shí)間成正比。,（a）分離不良，兩峰距離太近； （b）加大a值后，提高了選擇性，兩峰分開(kāi)； (c) 在a的基礎(chǔ)上，加大N提高柱效，使峰變窄，峰尖位置不變，但兩峰可以分離； (d) 增大K值，分離度好，但保留時(shí)間延長(zhǎng)，峰拖尾后譜帶變寬。 因此，利用式(5-8)使給定的分離最佳化時(shí)，首先調(diào)整K值，使K在2-5之間，譜帶不太寬，分離的時(shí)間亦合適，其次選擇N，以提高柱效，,三、裝置,高效液相色譜儀的設(shè)計(jì)與所采用的分離原理無(wú)關(guān)，可以購(gòu)買(mǎi)完整的 器，亦可以購(gòu)買(mǎi)單獨(dú)的部件組裝成適用的儀器。 典型的液相色譜儀由以下部件組成： 1.高壓輸液系統(tǒng)（貯液器、輸液泵、 梯度淋洗裝置 ） 2.進(jìn)樣系統(tǒng) （進(jìn)樣器

9、） 3.分離系統(tǒng)（色譜柱） 4.檢測(cè)系統(tǒng)（檢測(cè)器） 5.數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（記錄儀和積分儀） 流程見(jiàn)圖5-4,3.1. 高壓輸液系統(tǒng) 3.1.1 貯液容器 某些商品貯液器配備有流動(dòng)相脫氣的裝置，裝有加熱器，溫度調(diào)節(jié)器和磁力攪拌器。 流動(dòng)相的脫氣是非常重要的，因?yàn)槿軇┲腥芙獾目諝庠诘蛪翰考鐧z測(cè)器里會(huì)逸出氣泡來(lái)，氣泡的出現(xiàn)會(huì)使檢測(cè)器的噪聲加大。 常用的除氣方法有三種： 1) 加熱法 2) 抽真空法 3) 超聲波處理 可在貯液容器中充滿氮?dú)饣蚝夥乐鼓撤N溶劑被氧化,3.1.2高壓輸液泵 主要部件之一，壓力：150350105 Pa。 為了獲得高柱效而使用粒度很小的固定相（10m），液體的流動(dòng)相高速通過(guò)時(shí)

10、，將產(chǎn)生很高的壓力，因此高壓、高速是高效液相色譜的特點(diǎn)之一。 應(yīng)具有壓力平穩(wěn)、脈沖小、流量穩(wěn)定可調(diào)、耐腐蝕等特性,3. 1.3 梯度洗脫 氣相色譜分析是為了改善分離和縮短分析周期，采用程序升溫控制；而在液相色譜中，使用梯度洗脫。 所謂梯度洗脫是在一個(gè)色譜分析周期里不斷改變流動(dòng)相的化學(xué)組分，使一些復(fù)雜混合物的分析能做到： 1) 提高分辨能力； 2) 峰形得到改善； 3) 縮短分析周期。,3.2 進(jìn)樣系統(tǒng) 進(jìn)樣系統(tǒng)包括取樣、進(jìn)樣兩個(gè)功能，手動(dòng)自動(dòng)兩種方式，把樣品引進(jìn)色譜柱的方法有：進(jìn)樣器進(jìn)樣、閥進(jìn)樣、自動(dòng)進(jìn)樣器。 進(jìn)樣過(guò)程往往會(huì)影響分離效果，當(dāng)注入樣品后，由擴(kuò)散而導(dǎo)致峰形展寬；而在高壓狀態(tài)下進(jìn)樣，

11、難度較大；還要求進(jìn)樣時(shí)不影響輸液系統(tǒng)的壓力和流速，也不出現(xiàn)漏液等現(xiàn)象。,3.3 色譜分離系統(tǒng) 色譜柱是高效液譜儀的心臟部分。柱內(nèi)填充填料的種類不同，性能也不同，通常采用不銹鋼直形住，內(nèi)徑為2-4mm，長(zhǎng)度為15-30 cm，柱子加長(zhǎng)能改善分離，但要提高柱入口處的壓力，且加長(zhǎng)分析時(shí)間。 經(jīng)典的液相色譜填充劑：1) 顆粒大，直徑一般在l00 m以上；2) 粒度不均勻，3) 沒(méi)有一定形狀；4) 經(jīng)不住高壓。 高效液柏色譜填充劑：1) 顆粒小，直徑為10一30 m，最小為35m；2) 粒度均勻；3) 一般為球形；4) 能在高壓下工作。,樣品中如有吸附性的組分，會(huì)影響色譜柱的使用壽命，除了應(yīng)在進(jìn)色譜柱前

12、抽提或過(guò)濾外，最簡(jiǎn)單的辦法是在分析柱前連接一根3-5cm長(zhǎng)的保護(hù)柱，內(nèi)裝與色譜柱性能相同的填料，使用0.2m的過(guò)濾片，放在進(jìn)樣器和分析柱之間。 保護(hù)柱可防止來(lái)自流動(dòng)相和樣品中的不溶性微粒對(duì)色譜掛的堵塞，還可避免硅膠或鍵合相的流失，可維護(hù)柱效，保護(hù)柱并不能無(wú)限止地吸附雜質(zhì)，使用時(shí)應(yīng)觀察檢測(cè)器訊號(hào)，如有基線漂移、怪峰或柱壓增加等現(xiàn)象，說(shuō)明保護(hù)柱已被污染，應(yīng)更換填料。,3.4 檢測(cè)系統(tǒng)（檢測(cè)器） 檢測(cè)器是用于連續(xù)檢測(cè)柱流出物中不同組分及其含量的部件，主要用于監(jiān)測(cè)經(jīng)色譜柱分離后的組分濃度的變化，并由數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)繪出圖譜來(lái)進(jìn)行定性和定量分析。 3.4.1 理想的液相色譜監(jiān)測(cè)器應(yīng)具備如下特征： 靈敏度高；

13、 對(duì)所有的溶質(zhì)都有響應(yīng)； 響應(yīng)對(duì)流動(dòng)相流量和溫度的變化都不敏感； 不引起柱外譜帶擴(kuò)展； 線性范圍寬； 適用范圍廣,3.4.2 檢測(cè)器分為通用型檢測(cè)器和選擇性檢測(cè)器 常用的檢測(cè)器有紫外檢測(cè)器（UVD）、示差折光檢測(cè)器（RID）、電導(dǎo)檢測(cè)器（ECD）、熒光檢測(cè)器（FD）和蒸發(fā)激光散射檢測(cè)器（ELSD）等。 現(xiàn)在使用可調(diào)波長(zhǎng)的紫外可見(jiàn)分光檢測(cè)器，工作波長(zhǎng)可在190-700 nm范圍內(nèi)任選，應(yīng)用范圍大大增加，以氘燈和鎢燈為光源。,差示折光檢測(cè)器，是測(cè)量樣品和流動(dòng)相系統(tǒng)總的折光指數(shù)。為了得到足夠的響應(yīng)，采用差分技術(shù)補(bǔ)償流動(dòng)相的折光指數(shù)，任何物質(zhì)只要其折光指數(shù)與洗脫液有足夠的差別，就可以檢測(cè)，所以適用范圍

14、廣，但靈敏度低，選擇性差，受溫度干擾較大在農(nóng)藥分析中不常用。 二極管陣列檢測(cè)器（DAD） 此外還有電化學(xué)檢測(cè)器，敏感度高，但適用范圍小。,3.4.3 判定檢測(cè)器性能的指標(biāo)主要有以下幾方面： （1）靈敏度：以組分響應(yīng)曲線的斜率來(lái)表示，斜率愈大，表示靈敏度愈高。 （2）噪聲：與樣品無(wú)關(guān)的輸出信號(hào)的變化，除了由于儀器的電子系統(tǒng)、電源電壓或溫度的波動(dòng)外，洗脫液的氣泡和污染可能是出現(xiàn)噪聲的主要原因。 （3）漂移：基線隨時(shí)間增加而產(chǎn)生的定向緩慢變化，噪聲和漂移都直接影響檢測(cè)能力和分析工作的誤差。 （4）最小檢測(cè)限：色譜峰高度為最大噪聲兩倍時(shí)的檢出量。 （5）線性范圍：檢測(cè)器輸出信號(hào)與被測(cè)組分量呈線性關(guān)系的

15、范圍。,四、HPLC的分類,根據(jù)固定相對(duì)樣品分子的保留機(jī)理不同主要分為以下4種類型： 1液固吸附色譜 是用高比表面積的顆粒作固定相，根據(jù)物質(zhì)對(duì)吸附劑活性表面的吸附能力的差異而進(jìn)行分離。 2液液分配色譜 其固定相是由在組成上與流動(dòng)相互不相溶的另一種液體或是借化學(xué)鍵合到顆?；蜉d體上，物質(zhì)的分離是由于不同溶質(zhì)在兩個(gè)液相中分配系數(shù)不同而達(dá)到的。 3離子交換色譜 固定相是具有固定電荷的離子交換樹(shù)脂，是根據(jù)移動(dòng)相中樣本的不同離子對(duì)固定相固定電荷部位的親和力大小不同而進(jìn)行分離。 4. 化學(xué)鍵合相色譜法 5凝膠色譜或空間排阻色譜 固定相為不同孔徑的多孔凝膠，是根據(jù)多孔凝膠對(duì)不同大小的分子的排阻效應(yīng)進(jìn)行分離。,

16、4.1 液固吸附色譜法 液固吸附色譜是液相色譜中研究和應(yīng)用得最早的一種，以具有高比表面積的顆粒作為固定相，根據(jù)樣本中各組分對(duì)固定相表面吸附作用的差異進(jìn)行分離和分析的方法。 適用于分離溶于有機(jī)溶劑、具有中等分子量、非離子型的化合物，對(duì)于具有不同官能團(tuán)或不同數(shù)目的官能團(tuán)的組分分子，具有很好的選擇性，還特別適用于異構(gòu)體的分離。,在裝填有吸附劑的層析柱內(nèi)，當(dāng)流動(dòng)相流過(guò)吸附劑時(shí)，吸附劑表面被溶劑分子(S)以單分子層形式完全占有，當(dāng)樣本分子(X)(或溶質(zhì)分子)被流動(dòng)相帶人柱內(nèi)，在移動(dòng)的過(guò)程中便擴(kuò)散到吸附劑表面和微孔內(nèi)，并在所有表面上與已結(jié)合的溶劑分子（S）進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)吸附，見(jiàn)圖55。,如果試樣分子(X)對(duì)吸附

17、劑表面吸附基團(tuán)的吸引力(包括色散力、誘導(dǎo)力，氫鍵等)大于溶劑分子(S)，溶劑分子被排斥，試樣分子被吸附，則X取代S而吸附在吸附劑表面，稱為競(jìng)爭(zhēng)吸附現(xiàn)象。在一定的濃度范圍內(nèi)，這一吸附脫吸附過(guò)程是熱力學(xué)平衡過(guò)程，這種競(jìng)爭(zhēng)吸附達(dá)到平衡后，可用下式來(lái)表示： K為分配系數(shù)。 如果溶劑分子吸附性強(qiáng)，則被吸附的試樣分子(X)相應(yīng)減少。,4.1.1吸附色譜固定相的類別 常用的吸附劑主要有硅膠和氧化鋁等，氧化鋁有時(shí)會(huì)發(fā)生催化反應(yīng)，已很少使用。 硅膠吸附劑用得最多，其特點(diǎn)為： 化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，不會(huì)與試劑發(fā)生反應(yīng)； 機(jī)械性能強(qiáng)，不會(huì)溶漲； 由于多孔結(jié)構(gòu)而具有高的線性容量； 在制造過(guò)程中可以控制其物理性能，如比表面、孔

18、 結(jié)構(gòu)等。,吸附色譜主要是利用物質(zhì)在吸附劑和流動(dòng)相中的可逆平衡，以及吸附劑對(duì)不同物質(zhì)吸附力的差異而使物質(zhì)分離的。而高效液相色譜主要采用薄殼型硅膠和全多孔微粒型硅膠兩種結(jié)構(gòu)型的吸附劑填料(圖56)。,(1) 薄殼型硅膠： 是在平均粒徑為35m玻璃微球表面上涂覆l2m厚的薄層硅膠，這就提高了承受高壓的機(jī)械強(qiáng)度和填充的均勻性。薄殼型硅膠的傳質(zhì)過(guò)程快，有利于快速分析。其缺點(diǎn)是比表面積小，樣本負(fù)荷量小，柱效不夠高，應(yīng)用已逐漸減少。 (2) 全多孔微粒型硅膠： 高效液相色譜大多采用全多孔微粒型吸附劑，這類吸附劑粒徑小，填料微孔的相對(duì)深度也減小，常用5m和10 m二種，篩分范圍一般為2m左右，最高柱效可達(dá)80000一100000板m，它的優(yōu)點(diǎn)是柱效高，分離能力強(qiáng)，可使用較短的柱子，上樣量大，可降低最小檢測(cè)量。,4.2吸附色譜固定相的性質(zhì) 在液固吸附色譜中控制保留值和選擇性的重要因素是吸附劑的比表面積和表面活性。 4.2.1 比表面積S 吸附作用是發(fā)生在相界面上，被吸附物質(zhì)的量隨著吸附表面增大而增加，所以吸附劑的表面積愈大，被吸附的粒子就愈多。 吸附劑的孔徑和孔容量是與比表面積相關(guān)的參數(shù)。吸附劑的比表面積與孔徑大小成反比，孔徑愈大，比表面積愈