1、PCR技術(shù)的原理、操作及應(yīng)用,湖南省疾病預(yù)防控制中心微生物檢驗(yàn)科 黃一偉,什么是PCR,PCR: Polymerase chain reaction，即聚合酶鏈反應(yīng) 是80年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴(kuò)增技術(shù),PCR技術(shù)的發(fā)展歷史,關(guān)于PCR 的文章首次由美國科學(xué)家 Kary Mullis等人在 Science雜志上發(fā)表 Science雜志報(bào)道了耐熱性DNA多聚酶 Taq酶（生活在溫泉中的水生嗜熱桿菌內(nèi)提取到的一種耐熱的DNA聚合酶 ）的發(fā)現(xiàn),預(yù)示著分子時(shí)代的到來。12月Science雜志將PCR和它所使用的聚合酶命名為第一個(gè)“年度分子”。 1993 Kary Mullis 因PCR的發(fā)明獲得諾

2、貝爾化學(xué)獎。,PCR技術(shù)的原理 1,遺傳物質(zhì)： 細(xì)胞核 染色體 DNA（脫氧核糖核酸和磷酸鏈和堿基構(gòu)成) 堿基（A、T、C、G）是按雙鏈螺旋排列的，堿基序列的長度和排列的順序決定了生物的多樣性。 比如人類體細(xì)胞中共有31億個(gè)堿基對，按上述的0.1%的差，人和人之間有3百萬個(gè)堿基對的差別。 PCR的基本工作原理就是以擬擴(kuò)增的DNA分子為模板，以一對分別與模板互補(bǔ)的寡核苷酸片段為引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留復(fù)制的機(jī)理沿著模板鏈延伸直至完成新的DNA合成。,PCR技術(shù)的原理 2,PCR反應(yīng)的基本成分 包括7種基本成分：模板DNA、特異性引物、熱穩(wěn)定DNA聚合酶、脫氧核苷三磷酸（dNTP）

3、、二價(jià)陽離子、緩沖液及一價(jià)陽離子 基本反應(yīng)步驟 ：變性-退火-延伸 最后通過染料如EB染色DNA后在紫外燈下顯色檢出,PCR技術(shù)的原理 3,重復(fù)13步 2535輪,目的DNA片段 擴(kuò)增100萬倍以上,DNA雙螺旋,DNA單鏈 與引物復(fù)性,DNA變性 形成2條單鏈,子鏈延伸 DNA加倍,RT-PCR的原理,相對于PCR，在開始階段增加步驟：RNA cDNA合成，是單鏈到雙鏈的過程。,實(shí)時(shí)熒光定量PCR的原理 1,實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù) (Real-Time Quantitative PCR) 是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號積累實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)

4、行定量分析的方法。,常用的熒光定量PCR試劑： SYBR Green I Taqman水解探針,實(shí)時(shí)熒光定量PCR的原理 2,基線（Baseline） 是指在PCR擴(kuò)增反應(yīng)的最初數(shù)個(gè)循環(huán)里，熒光信號變化不大，接近一條直線，這樣的直線即基線。 光閾值threshold的設(shè)定 一般將PCR反應(yīng)前15個(gè)循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號，熒光域值是PCR3-15個(gè)循環(huán)熒光信號標(biāo)準(zhǔn)差的10倍，熒光域值設(shè)定在PCR擴(kuò)增的指數(shù)期。,CT(Cycle threshold)值 表示每個(gè)PCR反應(yīng)管內(nèi)熒光信號到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。研究表明，各模板的CT值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越

5、多，CT值越小，反之亦然。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)，縱坐標(biāo)代表CT值。因此，只要獲得未知樣品的CT值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)。,實(shí)時(shí)熒光定量PCR的原理 3,Ct與初始模板的關(guān)系 固定循環(huán)數(shù)后，熒光信號與模板數(shù)成正比 初始DNA量越多, 熒光達(dá)到閾值時(shí)所需要的循環(huán)數(shù)(Ct 值)越少 起始模板的對數(shù)濃度與Ct呈線性關(guān)系，根據(jù)樣品的Ct值就可計(jì)算出樣品中所含的模板量,PCR技術(shù)的優(yōu)點(diǎn),優(yōu)點(diǎn): 特異 敏感 快速、 簡便 易自動化等,PCR技術(shù)的局限性,為了構(gòu)建特定引物，使特定DNA序列的選擇性擴(kuò)增，必須有一個(gè)龐大的已知序列的數(shù)據(jù)庫。

6、聚合酶鏈反應(yīng)效率差異很大，根據(jù)不同的因素需要優(yōu)化反應(yīng)條件。 PCR技術(shù)擴(kuò)增產(chǎn)物的長度有限。,PCR技術(shù)的注意事項(xiàng),防止污染，建立良好的質(zhì)量控制。操作時(shí)避免氣溶膠產(chǎn)生，特別注意陽性樣品的拿放，使用一次性耗材，穿戴手套并經(jīng)常更換，永遠(yuǎn)在最后一步才加核酸，液體分裝使用等。 引物設(shè)計(jì)合理 Taq酶擴(kuò)增錯(cuò)誤率較高，大約1/100對堿基/20個(gè)循環(huán) 鎂離子濃度對反應(yīng)效率的影響 儀器穩(wěn)定性，升降溫速率，管子的密合度等 RT-PCR注意防止RNA降解,PCR技術(shù)的操作 1,以流感病毒的RT-PCR和Real-time RT-PCR檢測為例說明PCR技術(shù)的操作步驟 主要儀器：PCR儀，Real-time PCR

7、儀，微量移液器，高速冷凍離心機(jī)，電泳儀和電泳槽，凝膠電泳觀察儀或成像系統(tǒng)，生物安全柜等。,PCR技術(shù)的操作 2,1. 病毒核酸RNA提取 2. RT-PCR反應(yīng)或者Real-time RT-PCR反應(yīng) 3. UV紫外燈檢測或者電腦上直接讀取結(jié)果,流感病毒核酸提取 1,試驗(yàn)材料 QIAGEN公司的Rneasy Mini Kit (或QIAGEN公司的QIAmp Viral RNA Mini Kit，操作類似) -巰基乙醇（-mercaptoethanol） 70% 乙醇 無菌及DNA,RNA酶的1.5ml 離心管 10l、20l、200l、1000l加樣器和槍頭 可調(diào)13K微型冷凍離心機(jī) 待檢流

8、感病毒200l,流感病毒核酸提取 2,1、取采樣液（鼻拭子、咽拭子、胸水等）或病毒培養(yǎng)物（雞胚尿囊液或細(xì)胞培養(yǎng)液）200ul加在1.5ml Eppendorf管中 2、依次加入350ul RLT液、3.5ul-巰基乙醇和70%的乙醇550ul混勻 3、將Rneasy mini spin柱子置于干凈的2ml收集管上，將2步驟的混合液600ul吸出加入柱子中，12，000rpm，離心15秒，棄收集管中的離心液 4、柱子仍放回收集管上，將2步驟剩余的混合液全部吸到柱子上，12，000rpm，離心15秒，棄離心液 5、于柱子中加入700ul Wash Buffer RW1液，12，000rpm，離心1

9、5秒 6、取一支干凈的2ml收集管，將離心后的柱子移到新的收集管上，于柱子中加入500ul Wash Buffer RPE液，12，000rpm，離心15秒 7、棄收集管中的離心液，再于柱子中加入500ul Wash Buffer RPE液，13，000-14，000rpm，離心2分鐘 8、將柱子移到一干凈的1.5ml的eppendrof管上，于柱子中加入20-50ul的Rnase-free Water，室溫靜置1-3分鐘 9、12，000rpm，離心1分鐘，收集離心液即為提取的病毒RNA，立即做實(shí)驗(yàn)或-20以下保存 試劑盒為QIAGEN公司的RNeasy Mini Kit （catalog

10、#74104） 注意：試劑盒中的RPE液用前需加44ml 的無水乙醇，使終體積達(dá)到55ml。,RT-PCR反應(yīng) 1,試驗(yàn)材料 QIAGEN One Step RT-PCR Kit （Cat No 210212） RNase inhibitor 40u/l 上游引物 200ng/l 下游引物 200ng/l 擴(kuò)增H5亞型禽流感病毒的引物 序列為： H5-1: 5-GCC ATT CCA CAA CAT ACA CCC-3，H5-3: 5-CTC CCC TGC TCA TTG CTA TG-3 提取的RNA,RT-PCR反應(yīng) 2,1、 分別標(biāo)記好0.2ml的微量離心管。 在每個(gè)管中加入如下內(nèi)容：

11、 5 ul QIAGEN OneStep RT-PCR buffer，5 1 ul 10mM dNTPs 1 ul Enzyme Mix 0.13ul RNase inhibitor (40U/ul) 14.3ul Rnase-free water 2、 加 1ul 的引物 加 5ul 未知RNA或5 ul 陽性對照或Rnase-free water作為陰性對照。,RT-PCR反應(yīng) 3,OneStep RT-PCR反應(yīng)條件如下： 50作用30分鐘（逆轉(zhuǎn)錄：RNA cDNA） 95作用15分鐘（使逆轉(zhuǎn)錄酶等失活） 94變性30秒 55退火30秒 72延伸30秒 回到第3步，34個(gè)循環(huán) 72作用2

12、分鐘 結(jié)束,RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測 1,凝膠電泳緩沖液配方 10TBE緩沖液(每升) ：Tris107.8g Boric Acid55.0g EDTA(Na2)8.2g 10TAE緩沖液(每升) ：Tris48.4g 冰乙酸 11.42g 0.5mol/L EDTA 20ml 用電泳緩沖液制備1.5%瓊脂糖凝膠，按每孔8ulPCR產(chǎn)物上樣至膠中。 100伏電泳30min，紫外觀察并拍照記錄。,RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測 2,RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測及結(jié)果判定,Real-time RT-PCR的操作 1,病毒核酸RNA提?。和琑T-PCR Real-time RT-PCR：以匹基公司禽流感檢測試

13、劑盒為例，按試劑盒操作說明，25l反應(yīng)體系：RT-PCR反應(yīng)液 15l，Taq酶 0.25l，逆轉(zhuǎn)錄酶n/4顆（n為PCR管數(shù)），待檢RNA 10l，加好RNA后400g離心5sec，將PCR管排好放入熒光PCR檢測儀內(nèi)，記錄樣本擺放順序。反應(yīng)條件為：42 30min；92 3min；92 10sec, 45 30sec 72 1min 5個(gè)循環(huán)；92 10sec, 60 30sec 40個(gè)循環(huán)，60時(shí)設(shè)置收集熒光。,Real-time RT-PCR的操作 2,結(jié)果分析條件設(shè)定 讀取檢測結(jié)果。閾值設(shè)定原則以閾值線剛好超過正常陰性對照品擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn)，結(jié)果顯示陰性為準(zhǔn)；或可根據(jù)儀器噪音情況進(jìn)行

14、調(diào)整。,CT(Cycle threshold)值 表示每個(gè)PCR反應(yīng)管內(nèi)熒光信號到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。研究表明，各模板的CT值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，CT值越小，反之亦然。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)，縱坐標(biāo)代表CT值。因此，只要獲得未知樣品的CT值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)。,基線（Baseline） 是指在PCR擴(kuò)增反應(yīng)的最初數(shù)個(gè)循環(huán)里，熒光信號變化不大，接近一條直線，這樣的直線即基線。 光閾值threshold的設(shè)定 一般將PCR反應(yīng)前15個(gè)循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號，熒光域值是PC

15、R3-15個(gè)循環(huán)熒光信號標(biāo)準(zhǔn)差的10倍，熒光域值設(shè)定在PCR擴(kuò)增的指數(shù)期。,Real-time PCR的操作 3,結(jié)果判定 1、質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn) 1.1陰性對照的檢測結(jié)果為陰性。 1.2陽性對照的Ct值應(yīng)小于等于28.0。否則，此次實(shí)驗(yàn)視為無效。 2、結(jié)果判斷 2.1 Ct值無數(shù)值的樣本為陰性樣本。 2.2 Ct值30.0的樣本為陽性。 2.3Ct值大于30.0的樣本建議重做。重做結(jié)果無數(shù)值者為陰性，否則為陽性。,PCR技術(shù)的應(yīng)用,基因克隆、測序和表達(dá)等 法醫(yī)學(xué)個(gè)體識別和親子鑒定 遺傳性疾病檢測、腫瘤診斷、病原體檢測等,基因克隆和表達(dá),DNA指紋技術(shù) 1,1984年英國的遺傳學(xué)家Alec Jeffre

16、ys在進(jìn)行肌紅蛋白的DNA序列研究時(shí)，意外發(fā)現(xiàn)非功能DNA（不產(chǎn)生蛋白的DNA）上重復(fù)著一種小片段DNA，這一含15個(gè)左右堿基的DNA片段，在不同個(gè)體間重復(fù)的頻率及位置有明顯的不同，Jeffreys首先在自己的DNA上進(jìn)行研究，驗(yàn)證了這一技術(shù)，如果我們有血緣關(guān)系，這些不同會大大縮小。,Jeffreys命名這一技術(shù)為DNA指紋技術(shù)（DNA finger print）。,DNA指紋技術(shù) 2,采集血樣（毛發(fā)、精液、口腔粘膜細(xì)胞），分離DNA，用PCR將選定的DNA片段放大，并進(jìn)行對比，統(tǒng)計(jì)分析，便可得出是否為作案兇手或是否有血緣關(guān)系。,分子診斷學(xué),分子診斷學(xué)是以分子生物學(xué)理論為基礎(chǔ)，利用分子生物學(xué)的

17、技術(shù)和方法研究人體內(nèi)源性或外源性生物大分子和大分子體系的存在、結(jié)構(gòu)或表達(dá)調(diào)控的變化，為疾病的預(yù)防、預(yù)測、診斷、治療和轉(zhuǎn)歸提供信息和決策依據(jù) 。,分子診斷學(xué)的發(fā)展階段,分子診斷學(xué)大致經(jīng)歷了3個(gè)階段： （1）利用DNA分子雜交技術(shù)進(jìn)行遺傳病的基因診斷； （2）以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的DNA診斷，特別是定量PCR和實(shí)時(shí)PCR的應(yīng)用，不僅可以檢測存在于宿主的多種DNA和RNA病原體載量，還可檢測多基因遺傳病細(xì)胞中mRNA的表達(dá)量 （3）以生物芯片（biochip）技術(shù)為代表的高通量密集型檢測技術(shù)，生物芯片技術(shù)包括基因芯片，蛋白質(zhì)芯片，組織芯片等 。,分子診斷學(xué)的發(fā)展方向,分子診斷學(xué)的發(fā)展方向： （1）分子診斷的內(nèi)容從傳統(tǒng)的DNA診斷發(fā)展到核酸及其表達(dá)產(chǎn)物（mRNA、蛋白質(zhì)）的全面診斷； （2）分子診斷