1、酶活性濃度測定的主要影響因素及控制,酶（enzyme）,酶的應(yīng)用 臨床診斷酶學(xué)產(chǎn)生至今已有100年的歷史。 用于診斷的酶類已超過100多種，常用的數(shù)十種。 酶測定約占目前臨床化學(xué)總工作量的1/4到1/2。 酶的概念 是一種由活細胞產(chǎn)生，具有高度專一性、高度催化活性的特殊蛋白質(zhì)，又稱為生物催化劑。 酶的測定方法分為絕對定量法和相對定量法兩大類，以后者為主。 酶催化化學(xué)反應(yīng)的能力稱為酶活性（activity）。 酶活性濃度的測定受許多因素的影響。,酶活性濃度測定的主要影響因素,1. 標(biāo)本及標(biāo)本采集和處理因素 2. 試劑及方法學(xué)因素 3. 儀器因素的影響 4. 測定條件與參數(shù)設(shè)置,1.標(biāo)本及標(biāo)本采集

2、和處理因素的影響及控制,1.標(biāo)本及采集和處理的影響因素,1.1 溶血 1.2 抗凝劑 1.3 溫度 1.4 空氣與光線 1.5 標(biāo)本副反應(yīng) 1.6 酶蛋白濃度 1.7 其他,1.1 溶血,最重要的影響是RBC內(nèi)酶的大量釋出。 大部分酶在細胞內(nèi)外濃度差異明顯，且其活性遠高于血清； 如RBC內(nèi)的LD、AST和ALT活性分別較血清中高100、15和7倍左右。 RBC釋放的Hb在300500nm可見光波段能使吸光度值明顯升高，干擾分光光度計的測定。,1.1 Hb的吸光度曲線,1.1 溶血影響的控制,減少溶血 體外溶血可通過實施樣品制備技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)化加以克服； 分清體內(nèi)溶血與體外溶血。 減少溶血的干擾 可

3、通過設(shè)置樣品對照，或使用雙波長比色、連續(xù)監(jiān)測法以及改進商品試劑等措施，克服對分光光度分析的影響。 應(yīng)用血清(溶血)指數(shù)直接判斷溶血程度。,1.1 注意: RBC中酶的干擾,不僅表現(xiàn)在溶血影響上，采血后如不及時將血清和血凝塊分離，血細胞中酶同樣可以透過細胞膜進入血清， 所以，靜脈采血后，必須在12h內(nèi)及時離心，將血清與血細胞、血凝塊分離，以免引起誤差。,1.2 抗凝劑,臨床上除非測定與凝血或纖溶有關(guān)的酶，一般都應(yīng)以血清作為首選測定標(biāo)本。 大多數(shù)抗凝劑都在一定程度上影響酶活性， EDTA、草酸鹽和檸檬酸鹽等抗凝劑，它們?yōu)榻饘匐x子螯合劑； 在去除Ca2+同時也去除其中Mg2+、Mn2+等離子，Ca2

4、+是AMY的激活劑，Mg2+是ALP、CK和5-核苷酸酶（5-NA）的激活劑。,1.2 肝素,是一種粘多糖， 是對酶活性影響最小的抗凝劑， 對ALT、AST、CK、LD和ACP無影響， 適于急診時迅速分離血漿進行測定。,1.3 溫度,由于血清清蛋白對酶蛋白有穩(wěn)定作用，如無細菌污染，某些酶（如AST、-GT和ALP等）可在室溫保存13天活性不受影響。 有些酶極不穩(wěn)定，如血清前列腺ACP，在37放置1h，活性可下降50%。,1.3 貯存不同室溫體液酶的穩(wěn)定性（活性變化小于10%）,*酶不耐融化；與同工酶類型有關(guān)；標(biāo)本未酸化；#標(biāo)本加枸櫞酸或醋酸至pH 5,1.3 溫度影響的控制,及時檢測 低溫貯存

5、 大部分酶在低溫中比較穩(wěn)定，因此當(dāng)天不能測定時，應(yīng)在血清分離后置冰箱中冷藏。,1.4 空氣與光線,血清置于空氣中時， 血中CO2喪失極快，pH可在15min內(nèi)由7.4增至8.0，從而使對堿性環(huán)境敏感的ACP活性迅速下降。 某些酶易受光線破壞， CK可因吸收藍光而引起酶發(fā)生不可逆地失活，其失活程度與暴光時間的長短成正比。,1.5 副反應(yīng),副反應(yīng)是指酶促反應(yīng)體系中，除待測酶反應(yīng)外，其他非待測酶和物質(zhì)引起的干擾待測酶測定的反應(yīng)。 NAD（P）H是目前使用最多的指示反應(yīng)物質(zhì)。 體內(nèi)存在數(shù)以百計的氧化還原酶，它們的輔酶很多是一致的。 若存在內(nèi)源性代謝物，必然會相互干擾。,1.5 副反應(yīng)(酶偶聯(lián)法測ALT

6、),由于反應(yīng)體系中含有大量NADH和LD，可與血液標(biāo)本中所含丙酮酸反應(yīng)，引起340nm波長處吸光度下降，從而引起ALT活性測定誤差。 ALT活性測定的反應(yīng)式如下：,1.5 副反應(yīng)的控制,可通過加入副反應(yīng)抑制劑， 或?qū)悠愤M行預(yù)處理等方法給予排除。 雙試劑底物啟動模式因不增加成本、不耗費時間是最經(jīng)濟的方法。,1.6 酶蛋白濃度,酶蛋白在低濃度時易失活，可能是亞基易解離、易吸附于容器上和易發(fā)生表面變性之故。 酶蛋白在高濃度時較穩(wěn)定，但活性過高超過檢測儀器的線性范圍時，需將樣品進行稀釋或減少樣品用量后再行測定。 樣品稀釋后所測得的活性常偏高，可能與抑制劑被稀釋有關(guān)。,1.7 其他,樣本器皿的質(zhì)地和潔

7、凈度，采血部位，以及血清中過量的膽紅素、脂質(zhì)，樣品制備過程中的振搖等，均可引起酶活性改變。 季節(jié) 冬季氣溫低，血液凝固慢，血清分離時間延長，可引起血細胞內(nèi)酶釋至血清，加上血清與空氣長時間接觸，可使某些抑制劑遭到破壞，故冬季測定LD的活性較夏季高。,2. 試劑及方法學(xué)因素的影響及控制,2. 試劑及方法學(xué)的影響因素,酶的測定大多使用商品試劑盒 不同廠家酶試劑盒的測定原理、試劑配方（包括緩沖液、底物、添加劑等）、產(chǎn)品質(zhì)量、技術(shù)含量等常有區(qū)別。 常見的影響因素 2.1 定時法與連續(xù)監(jiān)測法 2.2 檢測底物或檢測產(chǎn)物 2.3 底物啟動模式與樣品啟動模式 2.4 正向反應(yīng)與逆向反應(yīng) 2.5 試劑的干擾作用

8、,2. 影響因素的控制,選購試劑盒時 要仔細閱讀試劑盒說明書； 了解試劑盒所用方法的原理、試劑配方等； 選擇IFCC或中華醫(yī)學(xué)會檢驗學(xué)會推薦的常規(guī)方法，或選擇公認(rèn)的測定方法。 使用時 定期對試劑盒的質(zhì)量進行監(jiān)測； 準(zhǔn)確性、重復(fù)性、穩(wěn)定性好，線性范圍寬； 正向型試劑空白吸光度低、反向型試劑空白吸光度高、試劑空白速率低、瓶間差小等。,2. 酶活性測定的原理,酶活性與速度的關(guān)系 *酶促反應(yīng)進程曲線,2.1 定時法與連續(xù)監(jiān)測法的選用,在條件許可的情況下，應(yīng)盡可能全部采用連續(xù)監(jiān)測法，少用或不用定時法。 連續(xù)監(jiān)測法可以選擇線性期的反應(yīng)速度來計算酶活性，測定結(jié)果可靠，是首選的方法。 但該方法儀器要求相對較高

9、。 在基層單位，某些酶采用定時法測定也可以得到比較準(zhǔn)確的結(jié)果。 ALP酶活性的測定，如加做樣品空白，兩法的結(jié)果準(zhǔn)確性相當(dāng)。,2.1 連續(xù)監(jiān)測法與定時法的酶促反應(yīng)時間進程曲線,2.2 檢測底物或檢測產(chǎn)物的選擇,取決于哪個更方便，測定的結(jié)果更準(zhǔn)確。 通常原則是選擇測定產(chǎn)物的生成量而不是底物的消耗量。 反應(yīng)時底物濃度高，反應(yīng)時間短； 這也是淀粉酶的碘淀粉比色法逐漸被色素源底物所取代的原因之一。 除部分測定NADH減少可以看成測底物的消耗量外，已很少采用測定底物消耗量的項目。,2.2 檢測底物或檢測產(chǎn)物的選擇,底物與產(chǎn)物 舉例 ALT測定（賴氏法-定時法） L-丙氨酸 + -酮戊二酸 -丙酮酸 + L

10、-谷氨酸 -丙酮酸 + 2，4-二硝基苯肼 2，4-二硝基苯腙 (紅棕色，=505nm) ALT測定（連續(xù)監(jiān)測法） L-丙氨酸 + -酮戊二酸 -丙酮酸 + L-谷氨酸,2.3 底物啟動模式與樣品啟動模式,底物啟動模式（IFCC推薦采用）。 指樣品先與缺乏某種底物的試劑1預(yù)孵育一定時間后，再加入內(nèi)這種底物的試劑2，開始啟動樣品中的待測酶的酶促反應(yīng)。 好處是在待測酶酶促反應(yīng)開始之前，可以除去某些干擾物，包括內(nèi)源性干擾物和外源性干擾物。 這種模式需要雙試劑劑型。 樣品啟動模式。 指反應(yīng)所需的試劑先混合在一起，然后加入樣品，依靠樣品中的待測酶來啟動酶促反應(yīng)； 只是在延滯期去除部分干擾物。 這種模式可

11、采用單一試劑劑型。,2.3 底物啟動模式與樣品啟動模式,雙試劑與單試劑酶促反應(yīng)時間進程曲線,2.3 需要注意,某些雙試劑劑型是基于試劑穩(wěn)定性考慮，并沒有將底物單獨作為第二試劑，也起不到消除內(nèi)源性干擾的作用。,2.4 正向反應(yīng)與逆向反應(yīng),一般根據(jù)測定底物或產(chǎn)物的難易程度來決定。 除原則上選擇對底物親和力大，酶轉(zhuǎn)換率高的方向外，還應(yīng)考慮內(nèi)源性干擾、底物價格和穩(wěn)定性等諸多因素。 例如， CK的測定普遍采用逆向反應(yīng)，因其逆向反應(yīng)是正向反應(yīng)的6倍，而且受影響因素少。,2.4 正向反應(yīng)與逆向反應(yīng),LDH測定的選擇目前尚有爭議。 國內(nèi)多采用正向反應(yīng)（LP），與IFCC在2001年發(fā)表的操作手冊一致。 正向反

12、應(yīng)有利于LD1的活性表達，同時試劑成本低廉，穩(wěn)定性好。 國外常用方法曾是逆向反應(yīng)（PL）， 反應(yīng)速度是正向的3倍，成本也較低。,2.5 檢測試劑的干擾作用,試劑酶的污染。 組織勻漿中往往含有NADH-細胞色素C還原酶，它將干擾各種還原酶的測定。 底物的非酶反應(yīng)。 很多硝基酚的酯類衍生物在水溶液中不穩(wěn)定，放置一段時間可自行水解釋放出硝基酚。 如堿性磷酸酶（ALP）測定 解決的方法 是通過試劑空白管檢出并加以校正。 選購IFCC或中華檢驗學(xué)會推薦的方法和質(zhì)量好的試劑。,3. 儀器因素的影響及控制,3 儀器的影響因素,加樣系統(tǒng) 加樣的準(zhǔn)確性、重復(fù)性和攜帶污染； 反應(yīng)系統(tǒng) 反應(yīng)杯的形狀、表面和攜帶污染

13、； 反應(yīng)杯和反應(yīng)槽溫度的準(zhǔn)確性、波動范圍； 攪拌和清洗機構(gòu)的效果和攜帶污染； 檢測系統(tǒng) 光度計的準(zhǔn)確性、重復(fù)性、線性范圍和雜散光等均會造成結(jié)果的偏差。,3 儀器影響因素的控制,在日常工作中，除常規(guī)做好儀器和設(shè)備的正確使用和維護外， 重點應(yīng)注意儀器的校準(zhǔn)問題。,3.1 酶活性濃度的計算公式,摩爾吸光系數(shù) 和系數(shù) K 均為常數(shù)， 和 K受儀器諸多因素的影響， 如波長的準(zhǔn)確性、半波寬的大小、比色池光徑及磨損與清潔度、溫控的準(zhǔn)確性、加樣系統(tǒng)狀況等。 和 K 可用校準(zhǔn)物定期校正。,3.2 校準(zhǔn)物,可用作酶活性測定用的校準(zhǔn)物分兩類。 一類是產(chǎn)物的基準(zhǔn)物質(zhì)， 如對硝基酚、對硝基苯胺等， 用于校準(zhǔn)儀器的 值（

14、摩爾吸光系數(shù)）。 另一類稱酶校準(zhǔn)物（Enzyme calibrator）， 多是用人血清或動物血清作介質(zhì)，與測定標(biāo)本比較接近， 用于校準(zhǔn)儀器的 K 值（酶活性濃度定量系數(shù)）。,3.2 校準(zhǔn)物,國際上已經(jīng)有經(jīng)IFCC認(rèn)可的CRM酶參考物。 各試劑供應(yīng)商所提供的酶校正物的定值應(yīng)可溯源至CRM酶參考物。 常規(guī)工作一般選用用于常規(guī)實驗室的工作校準(zhǔn)品。 目前，臨床常規(guī)實驗室應(yīng)用較多的是德國寶靈曼公司的校準(zhǔn)品(c.f.a.s)。,3.3 的校準(zhǔn)（340 nm波長）,NAD(P)H是酶活性測定中常用的指示輔酶。 在340nm的NAD(P)H的，可用葡萄糖己糖激酶法實測、計算其實測的。 NAD(P)H的為62

15、20。 如果6 0006600為不合格，則需找維修部檢查。 注：干涉濾光片者需校準(zhǔn)，光柵式可直接使用文獻或試劑盒說明書的數(shù)值。,3.3 的校準(zhǔn)（405 nm波長）,最常用的色素原為對硝基苯酚等。 對硝基苯酚在405 nm的，可用ALP測定試劑的緩沖液作為測定試劑，對硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)液作為血清標(biāo)本，實際測定計算值。 對硝基苯酚的為18700。如果值偏差過大，則需找維修部檢查。,3.4 K的校準(zhǔn)（公式計算法）,將上述實測值代入K值計算公式得到校準(zhǔn)K值外。,3.4 K的校準(zhǔn)（酶校準(zhǔn)物）,使用公認(rèn)的酶校準(zhǔn)物對K值進行校準(zhǔn)，它是國際上目前酶測定標(biāo)準(zhǔn)化新途徑。 使用酶校準(zhǔn)物的優(yōu)點， 除具有實測值換算出的校準(zhǔn)K

16、值所具有的一切優(yōu)點外， 還可促進方法間的一致性和增加常規(guī)酶方法的可靠性，可使不同實驗室之間的測定結(jié)果相對統(tǒng)一。,3.4 K的校準(zhǔn)（頻率）,最好（低）每半年進行一次酶活性的校準(zhǔn)。 儀器在使用過程中，濾光片、加樣系統(tǒng)的精度都可能發(fā)生變化，光學(xué)系統(tǒng)的燈泡、光電轉(zhuǎn)換元件的老化、靈敏度變化等，都會導(dǎo)致測定結(jié)果的偏差。 但日常工作中，遇到下列情況時，必須進行校準(zhǔn)： 試劑盒改變廠家，或者更換了批號； 儀器性能改變，如進行一次大的預(yù)防性維護或者更換了重要部件； 質(zhì)控反映出異常的趨勢或偏移，或者超出實驗室規(guī)定的接受限，采取一般性糾正措施后，不能識別和糾正問題時。,4. 測定條件與參數(shù)設(shè)置,4.1 最適條件包括,

17、合適的底物和最適底物濃度； 理想的緩沖液種類和最適離子強度； 反應(yīng)液的最適pH； 最適反應(yīng)溫度； 合適的輔因子、激活劑濃度； 若是酶偶聯(lián)反應(yīng)，還需要確定指示酶和輔助酶的用量； 合理的測定時間，包括延滯期盡量短暫，有足夠的線性期； 合適的樣品與反應(yīng)試劑的比例； 足夠的檢測范圍； 盡量去除各種抑制劑等。,4.2 反應(yīng)溫度,目前常規(guī)實驗室越來越多的使用37，這更多地是從實際工作方便來考慮。 1986年以前，IFCC推薦酶活性測定的溫度是30，純鎵的熔點為29.77，鎵作為此溫度的基準(zhǔn)物質(zhì)，保證了測定儀器在30的高度準(zhǔn)確性。 2001年，IFCC正式發(fā)表了“37下檢測酶催化活性濃度的IFCC一級參考方

18、法操作手冊和參考制品認(rèn)可系統(tǒng)”，包括CK、LD、ALT、AST、GGT五個酶在內(nèi)。,4.2 反應(yīng)溫度,酶活性與酶促反應(yīng)溫度的關(guān)系,4.3 延滯期、線性期的確定,延滯期的確定 延滯期可以因酶在樣品中所存在的介質(zhì)不同而略有差別，原因可能是存在內(nèi)源性干擾物，也可能存在一些抑制劑。 確定原則是多觀察濃度不等、病理情況不同的標(biāo)本，選擇延滯期最長者作為確定值。 線性期的確定 離不開酶濃度的可測上限，因為酶濃度越高，在同樣時間內(nèi)消耗底物越多，產(chǎn)生產(chǎn)物越多，底物的不足和產(chǎn)物的抑制將導(dǎo)致非線性期的提前到來。,4.3 延滯期、線性期的確定,線性期與非線性度的大小有關(guān)，沒有絕對意義上的線性期，線性期是以指定的非線性度作為判斷基礎(chǔ)的。 線性期如何確定呢？主要看讀數(shù)次數(shù)和讀數(shù)間隔來決定，為了計算非線性度，按最小二乘法的計算要求，讀數(shù)次數(shù)應(yīng)不少于4次，讀數(shù)間隔按一般儀器要求30秒就足夠了，線性期在2分鐘以上即可。 中華醫(yī)學(xué)會檢驗學(xué)會規(guī)定酶活性測定要求線性期不短于2.5分鐘。若規(guī)定線性期不短于2.5分鐘可以測得酶活性的最高濃度就是該法的測定上限。,4.3 延滯期、線性期的確定,單試劑與雙試劑酶促反應(yīng)時間