蘭州大學(xué)碩士學(xué)位論文 人腺病毒南京、蘭州、湖南 地方株型別鑒定及 基因序列進(jìn)化 分析 第一章 引言 腺病毒簡介 腺病毒科（ 主要由五個(gè)屬組成： 腺病毒（ ， 為 腺病毒科 的 哺乳動(dòng)物腺病毒屬（ 成 員之一 。 953 年，是 人從健康人萎縮的扁桃腺樣組織中分離培養(yǎng)出來的， 1954 年 人 在患有急性呼吸道感染患者的咽喉 洗液中分離到同樣的病毒，命名為人腺病毒 1,2。 引起人類呼吸道感染的主要病原體之一，尤其對(duì)免疫功能異常的人群和兒童易感 3,4。臨床表現(xiàn)為廣泛的疾病譜，包括上下呼吸道感染、病毒性胃腸炎、流行性或爆發(fā)性 角膜 結(jié)膜炎，還可引起一些罕見的并發(fā)癥，如腦膜腦炎、急性出血性膀胱炎及肝炎。有報(bào)道研究表明 人 腺病毒感染與肥胖有關(guān) 5據(jù)研究報(bào)道顯示：二十世紀(jì)八九十年代對(duì)全世界范圍內(nèi)引起人呼吸道感染性疾病的病毒進(jìn)行分離鑒定，其中腺病毒占了 13%5,8迄今為止，已發(fā)現(xiàn)人腺病毒有 67 種血清型，分屬于 7 個(gè)不同亞組 A G118,66。其中，與呼吸道疾病密切相關(guān)的是 B、 C 和 E 組，即是引起兒童急性呼吸道感染的重要病原之一，尤其是在嬰幼兒和免疫缺陷者中可致嚴(yán)重的下呼吸道感染甚至死亡 17 為一種可導(dǎo)致廣泛疾病譜的病毒在全世界范圍內(nèi)流行，可發(fā)生局部的暴發(fā)流行，因而受到世界各國的重視，如美國、韓國、日本都相繼建立了連續(xù)多年的腺病毒監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò) 8,9,18。在中國，北京市、蘇州市、南京市和武漢市等地也有對(duì)腺病毒的監(jiān)測(cè)研究 21 形態(tài)與特征 包膜， 核衣殼呈二十面體立體對(duì)稱，直徑 90右，腺病毒基因組為線性雙鏈 裹在由 252 個(gè)殼粒（ 成的病毒顆粒中27。腺病毒的 核 衣殼由 三個(gè)主要表面結(jié)構(gòu)組成： 六鄰體蛋白（ 纖維蛋白（ 五鄰體蛋白（ 。 其中五鄰體位于腺病毒二十面體的 12 個(gè)頂角，每個(gè) 面有一條長度 10纖維突起（ 即為纖維蛋白，構(gòu)中的抗原決定簇決定了部分決定了病毒的種特異性和亞屬特異性。另外 240 個(gè)非頂角殼粒即為六鄰體（ 每個(gè)六鄰體蛋白表面攜帶有主要的屬和亞屬以及次要的種特異性抗原決定簇 28,29。病毒基因組雙鏈 占病毒蘭州大學(xué)碩士學(xué)位論文 人腺病毒南京、蘭州、湖南 地方株型別鑒定及 基因序列進(jìn)化 分析 質(zhì)量的 13%，與病毒多肽 V（ 368 個(gè)氨基酸）、 174 個(gè)氨基酸）和末端蛋白（ 671 個(gè)氨基酸）等蛋白質(zhì)構(gòu)成病毒核心，其中核心蛋白最主要的衣殼蛋白包裹著腺病毒基因組雙鏈 圖 1圖 1 圖 1形態(tài)結(jié)構(gòu)圖 1結(jié)構(gòu)和成分 （ a）腺病毒二十面體的表面結(jié)構(gòu)。（ b）腺病毒內(nèi)部組成部分。 蘭州大學(xué)碩士學(xué)位論文 人腺病毒南京、蘭州、湖南 地方株型別鑒定及 基因序列進(jìn)化 分析 因組結(jié)構(gòu)與編碼蛋白概述 人腺病毒全基因組長約 32兩端各有一個(gè)長約 100同的血清型其長度不均一）的反向末端重復(fù)區(qū) ( 側(cè)為病毒包裝信號(hào)（ ），主要介導(dǎo)腺病毒基因組裝配進(jìn)入病毒衣殼。 列中第9核苷酸高度保守，一般在其內(nèi)末端及相鄰區(qū)域中有 列， 病毒的基因組含有兩個(gè)相同的復(fù)制起始子，分別位于基因組結(jié)構(gòu)兩端的 30,31。根據(jù)腺病毒遺產(chǎn)物質(zhì) 制的起始時(shí)間，基因組的轉(zhuǎn)錄 過程主要分為早期轉(zhuǎn)錄和晚期轉(zhuǎn)錄兩個(gè)過程。 1B、 個(gè)非連續(xù)的轉(zhuǎn)錄單位 稱為 早期轉(zhuǎn)錄基因 （ E） ， 主要調(diào)節(jié)病毒 轉(zhuǎn)錄和翻譯， 晚期轉(zhuǎn)錄單位 （ L）包括 要與結(jié)構(gòu)蛋白的裝配和 復(fù)制有關(guān) 31。晚期轉(zhuǎn)錄起始于主要晚期啟動(dòng)子 (其功能為參與腺病毒基因組的調(diào)控。早期基因 于腺病毒基因組的左側(cè)，表達(dá)蛋白與腺病毒感染引起細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化密切相關(guān)，主要功能是作為病毒基因 活動(dòng)的起始因子，為病毒復(fù)制所必需，參與病毒基因和有關(guān)細(xì)胞基因的轉(zhuǎn)錄； 碼 合蛋白，主要作用是參與及調(diào)節(jié)病毒遺傳物質(zhì) 復(fù)制； 編碼一種糖蛋白，這種糖蛋白出現(xiàn)在宿主細(xì)胞表面 ，作為 病毒復(fù)制的非必需區(qū) ， 核苷酸序列的的 缺 失或者丟失 ， 對(duì) 病毒 的增殖無影響， 能在 其敏感 細(xì)胞中增 殖 。早期轉(zhuǎn)錄基因表達(dá)產(chǎn)物與病毒逃避宿主免疫反應(yīng)也密切相關(guān)； 因區(qū) 位于基因組的右側(cè)，與病毒遺傳物質(zhì) 復(fù)制、轉(zhuǎn)錄子的拼接及晚期基因表達(dá)等活動(dòng)都密切相關(guān)，且受 編碼的 合蛋白的 調(diào)控 31而晚期 轉(zhuǎn)錄 基因（ L）主要編碼病毒衣殼結(jié)構(gòu)蛋白，為裝配成熟的病毒顆粒所必需，所以晚期基因的結(jié)構(gòu)相對(duì)比較穩(wěn)定。晚期轉(zhuǎn)錄區(qū)域有一個(gè)共同的三聯(lián)前導(dǎo)序列 (由 5端 200 個(gè)核苷酸構(gòu)成。轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為長達(dá)約 29核苷酸轉(zhuǎn)錄物，通過各種方式的剪切加工，產(chǎn)生大量的 18 種不同的 些翻譯成不同的病毒蛋白。 表 1腺病毒各個(gè)轉(zhuǎn)錄基因的功能 腺病毒基因 功能 早期轉(zhuǎn)錄基因（ E） 2， 3， 4 腺病毒基因的轉(zhuǎn)錄， 復(fù)制，宿主免疫抑制及抑制宿主細(xì)胞凋亡 延遲轉(zhuǎn)錄的早期轉(zhuǎn)錄基因： 裝配腺病毒顆粒 晚期轉(zhuǎn)錄基因（ L） 2， 3， 4， 5 編碼病毒毒的衣殼蛋白 蘭州大學(xué)碩士學(xué)位論文 人腺病毒南京、蘭州、湖南 地方株型別鑒定及 基因序列進(jìn)化 分析 圖 1腺病毒的基因組模式圖 因的結(jié)構(gòu)和特點(diǎn) 人腺病毒編碼的主要結(jié)構(gòu)蛋白有六鄰體蛋白（ 五鄰體蛋白（ 纖維蛋白（ 87。研究已經(jīng)證實(shí) 白主要攜帶有主要的屬和亞屬特異性抗原決定簇以及次要特異性抗原決定簇 32,35 白由大約 900 多個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，富含羥基氨基酸，且氨基末端多乙?；?。脯氨酸殘基在肽鏈中成對(duì)排列，中間相隔 1其他氨基酸殘基，多肽兩端極為保守的區(qū)域中 分布著57 個(gè)脯氨酸 。 白 的沉降系數(shù)常在 13s 左右， 含有 三個(gè)相同的亞基。各個(gè)不同的血清型腺病毒株之間的 基酸序列同源性高達(dá) 99%，變異區(qū)集中在胰蛋白酶敏感的位點(diǎn)附近，即第 140之間，這一區(qū)域可能含有型特異性抗原決定簇 31。 目前在蛋白結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫 三維結(jié)構(gòu)圖直接可以提供抗原表位的 信息，但是對(duì)于腺病毒各個(gè)型別的 33腺病毒六鄰體多肽晶體結(jié)構(gòu)的 X 衍射研究表明，其三維結(jié)構(gòu)可分為致密的底座區(qū)，由一個(gè)五面體構(gòu)成，而由底座區(qū)伸出的塔型區(qū)為三角形，具有 4 個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu) 座區(qū)有 個(gè)區(qū)域，它們通過其內(nèi)部環(huán)連在一起成為兩條反向平行 折疊。塔型區(qū)的 曲成團(tuán)，與另外兩條 肽鏈的塔型區(qū)相互作用形成同源三聚體，結(jié)構(gòu)最長，最復(fù)雜的 提供了六鄰體與外界相互作用的結(jié)構(gòu)域。 個(gè)高變區(qū)（ 除了 于 中以外，其余的 6 個(gè)高變區(qū) 位于 中。不同血清型 的 白 核苷酸序列及氨基酸的二級(jí) 結(jié)構(gòu)研究發(fā)現(xiàn)， 構(gòu)是由 保守區(qū)（ 高變區(qū)（ 成。 1 和 要集中在 個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu) 36。 于蛋白質(zhì)分子表面，與腺病毒的型特異性有關(guān)。 白能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體以及組和型特異性抗體，是第一個(gè)被蘭州大學(xué)碩士學(xué)位論文 人腺病毒南京、蘭州、湖南 地方株型別鑒定及 基因序列進(jìn)化 分析 結(jié)晶的動(dòng)物蛋白。其多肽的第 281和第 441氨基酸構(gòu)成了型特異性抗原決定簇。此外，利用單克隆抗體還發(fā)現(xiàn)在六鄰體型特異性抗原與屬特異性抗原之間存在有兩組亞型特異性抗原決定簇（ 不同血清型別的分離培養(yǎng)株 白表面 數(shù)量不等， 組成形式包括順 序（ 原和構(gòu)象（ 原。緊接著又有研究發(fā)現(xiàn)：僅依靠六鄰體基因高變區(qū)來確定型特異性可能會(huì)導(dǎo)致錯(cuò)失了其他重要的分離株的遺傳差異，這些變異可能與宿主免疫反應(yīng)和菌株毒力相關(guān)。比如，纖維蛋白具有細(xì)胞受體結(jié)合位點(diǎn)，而這些結(jié)合位點(diǎn)的改變可以改變的腺病毒的組織嗜性。同樣，某些腺病毒早期蛋白編碼基因可能會(huì)影響腺病毒細(xì)胞之間的傳播 37因此，六鄰體基因測(cè)序方法與其他分子分型方法值得進(jìn)一步研究，以減少漏掉重要的重組腺病毒風(fēng)險(xiǎn)。 變區(qū)的結(jié)構(gòu) 腺病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白，含有大量的組和亞組特異性抗原表位，約2800苷酸，每個(gè)六鄰體都是一個(gè)同源三聚體，由 900 多個(gè)氨基酸殘基組成40,41。在 白 的三聚體表面，大部分組和亞組特異性的抗原決定簇存在于 3 個(gè)環(huán)上， 對(duì)應(yīng)的氨基酸中，有 250 個(gè)變化的氨基酸殘基，分為 7 個(gè)獨(dú)特的高變區(qū)（ 37， 些腺病毒的 不同血清型之間長度是不相同的， 7 個(gè) 間的區(qū)域?yàn)楸Ｊ匦园被嵝蛄?，它們?cè)诤艽蟪潭壬蠜Q定了不同血清型腺病毒的抗原特異性，其中 氨基酸殘基序列變化最多的高變區(qū)。由下圖我們可以清楚的看到 內(nèi)部結(jié)構(gòu)， 外部支撐區(qū)。 于 白的塔尖。所以我們不難得出： 3， 4， 5， 7都位于 白的表面，在決定組和亞組特異性抗原表位起至關(guān)重要的作用，因此對(duì)這 5 個(gè) 域的氨基酸序列進(jìn)行重組和突變，可能逃避腺病毒對(duì)人體預(yù)存的免疫，從而對(duì)研究腺病毒疫苗和載體起到啟發(fā)作用。 蘭州大學(xué)碩士學(xué)位論文 人腺病毒南京、蘭州、湖南 地方株型別鑒定及 基因序列進(jìn)化 分析 圖 1腺病毒 因高變區(qū)（ 域的顏色：黃色， 色， 藍(lán)色， 色， 色，色， 色， 病毒的疾病相關(guān)性 流行病學(xué)特點(diǎn) 腺病毒感染可累計(jì)呼吸道、消化道、泌尿系和眼部等組織，呼吸道疾病最常見，臨床上多表現(xiàn)為普通感冒，喉嚨痛（咽炎），支氣管炎及肺炎等。相對(duì)罕見的可造成膀胱炎、胰腺疾病和中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病 42在我國，腺病毒感染所致的嬰幼兒肺炎曾 一度 非常 流行 ，導(dǎo)致兒童很高的致病率和死亡率， 后隨著醫(yī)療水平的不斷提高，腺病毒檢測(cè)方法的改進(jìn)，全國范圍規(guī)范化監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)的建立 21腺病毒感染的發(fā)病率和病死率均顯著有所下降。然而近年來腺病毒感染又有增加的趨勢(shì)，不僅是引起輕型的呼吸道感染，也引起一些重癥感染和暴發(fā)流行。按其基因組結(jié)構(gòu)、免疫學(xué)、生物學(xué)和生物化學(xué)的特性，目前 研究發(fā)現(xiàn)的血清型（候選血清型）已有 67 個(gè) ，這些 血清型分為 7 個(gè)亞組，即 。其中最常見的 46,47， 40 型和 41 型 48呼吸道感染多以 3、 7、 11 型為主，主要的臨床癥狀為高熱、咳嗽、咽痛，少數(shù)會(huì)引起肺炎，可同時(shí)伴有咽結(jié)膜炎，尤其對(duì)嬰幼兒 及免疫缺陷的患者 易感 30。 道感染多為 40、 41 型腺病毒，其臨床表現(xiàn)為不同程度的腹瀉，多為蛋花湯樣，伴嘔吐。 表 1不同亞組不同血清型人腺病毒感染相關(guān)疾病 蘭州大學(xué)碩士學(xué)位論文 人腺病毒南京、蘭州、湖南 地方株型別鑒定及 基因序列進(jìn)化 分析 腺病毒亞組 血清型 相關(guān)臨床疾病 A 8,31 呼吸道、泌尿道及消化道疾病 B ,11,14,16,21,34,35,50,55 呼吸道、 眼部、泌尿道和消化道疾病 C ,5,6,57 呼吸道、泌尿道和消化道疾病 D 3,15,17,19,20,222,33,3621,53,54,56,58,65,67 眼部和消化道疾病 E 部和呼吸道疾病 F 1 消化道疾病 G 化道疾病 預(yù)防與控制 人 腺病毒感染主要在冬春季流行，容易在幼兒園、學(xué)校和新兵軍營等封閉環(huán)境的人群暴發(fā) 感染 。腺病毒主要通過咳嗽、噴嚏 等呼吸道飛沫的呼吸道方式，密切接觸眼部分泌物及腸道感染時(shí)的消化道三種方式傳播 50其預(yù)防措施和其他呼吸道、消化道傳染病預(yù)防類似，主要是勤洗手，多消毒，避免接觸患者及其呼吸道飛沫。平常多飲水，多吃蔬菜和水果，注意鍛煉身體；室內(nèi)多通風(fēng)，保持室內(nèi)環(huán)境清潔；冬春流行季節(jié)盡量少去人員密集的公共場(chǎng)所，外出時(shí)戴口罩，避免接觸病人，以防感染。此外加強(qiáng)游泳池和浴池水的消毒，可使水傳播性結(jié)膜炎爆發(fā)的危險(xiǎn)性降至最小，在做眼部檢查時(shí)應(yīng)嚴(yán)格無菌操作，對(duì)所用設(shè)備充分滅菌，也可控制流行性結(jié)膜炎的發(fā)生。如果發(fā)生急性發(fā)熱、咽喉疼痛 和流行性角膜結(jié)膜炎等臨床癥狀，應(yīng)及早到醫(yī)院觀察，進(jìn)行早隔離、早治療。 目前對(duì)腺病毒感染的治療仍無有效抗病毒藥物。關(guān)于腺病毒疫苗， 1971 年曾使用過 口服的減毒活疫苗，隨后的臨床隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)表明：這種疫苗能降低 50%吸系統(tǒng)疾病的發(fā)生 54,55，更能降低腺病毒相關(guān)呼吸道疾病的發(fā)病率 95%及時(shí)的阻斷疾病的爆發(fā) 55,56。然而，在 1992 這種疫苗的唯一的制造商出于經(jīng)濟(jì)原因年停止生產(chǎn)。之后美國 4 個(gè)軍事訓(xùn)練中心建立了以軍隊(duì)內(nèi)部人員為基礎(chǔ)的腺病毒監(jiān)控，但由于疫苗的空白 ，腺病毒感染越來越廣泛。直到 2011 年 3 月 16 號(hào)，美國食品和藥物管理局（ 準(zhǔn)使用由美國 藥公司 驗(yàn)室生產(chǎn)的， 腺病毒疫苗，這種疫苗目前推薦只使用在軍事人員（年齡 17），研究顯示能有效降低腺病毒引起的急性呼吸道傳染病的風(fēng)險(xiǎn)。但此種疫苗對(duì)一般感染人群未批準(zhǔn)使用 57,59。蘭州大學(xué)碩士學(xué)位論文 人腺病毒南京、蘭州、湖南 地方株型別鑒定及 基因序列進(jìn)化 分析 將來可能使用人二倍體細(xì)胞培養(yǎng)的減毒活疫苗來預(yù)防腺病毒感染。但諸多動(dòng)物模型研究顯示：腺病毒對(duì)動(dòng)物具有致癌作用，人們對(duì)全病毒疫苗的作用與安全性存有疑慮。 分型及分型 方法 腺病毒在自然界分布非常廣泛，迄今所知至少有 100 多個(gè)不同的血清型。人腺病毒 屬于 腺病毒科的哺乳動(dòng)物腺病毒屬。到目前為止，根據(jù)分子生物學(xué)和免疫學(xué)方法分型，已發(fā)現(xiàn)的人類腺病毒有 60 多個(gè)不同的血清型別，分為 A、 B、 C、D、 E、 F、 G 七個(gè)亞組 11,13,15,16， 60，如下圖所示，不同血清型具有不同的生物學(xué)特性，對(duì)人體不同的組織感染具有不同的傾向性，且 1/3 的血清型感染人類不同的組織能引起相應(yīng)組織的病變。其中 于腺病毒的 A 組，多引起呼吸道、泌尿道、消化道 感染。有研究表明 持續(xù)隱性感染與腹部疾病的發(fā)病機(jī)制相關(guān) 55。 于腺病毒 B 組，主要導(dǎo)致呼吸道氣管支氣管炎、肺炎、咽結(jié)膜炎、尿道感染及胃腸道炎癥 88,89。 尤其 嬰幼兒呼吸道感染最常見的腺病毒血清型，能引起腺病毒的感染爆發(fā)，且病死率高達(dá)約 12% 16,46,54,61。 于 腺病毒 C 組，同腺病毒 A 組主要引起兒童呼吸道疾病，但有報(bào)道顯示此組腺病毒導(dǎo)致的疾病臨床癥狀相對(duì)較輕。人腺病毒 D 組的成員比較多，包括 3， 要易侵犯眼部和消化道及腎臟和尿道感染，眼部疾病相對(duì)比較常見，表現(xiàn)為流行性眼結(jié)膜炎 63,86,90。 新發(fā)現(xiàn)的兩個(gè)血清型，均是從急性胃腸炎患兒糞便標(biāo)本分離的，為 D 組其他血清型的重組株 11,66。 E 組腺病毒目前發(fā)現(xiàn)只有一個(gè) 要導(dǎo)致眼部和呼吸道病變，且好多研究發(fā)現(xiàn)它可造成新兵的 暴發(fā) 和流行感染 54,58。 于 F 組腺病毒，是引起兒童腹瀉常見的主要病原體之一，僅次于輪狀病毒 49,62。 G 組唯一的亞型，是 2007 年 人在一次爆發(fā)性胃腸炎患著恢復(fù)期的糞便標(biāo)本中分離的，與 猴腺病毒屬 1 型（ ）核苷酸序列同源性最高 67,68。 分型方法大體概括可分為兩類：免疫學(xué)分型方法和分子生物學(xué)分型方法。前者主要包括對(duì)腺病毒外層蛋白衣殼上抗原和抗體的檢測(cè)，即有經(jīng)典的血凝抑制試驗(yàn)和特異性抗血清中和試驗(yàn)外，還有免疫熒光檢測(cè)，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ 64,71等。 研究實(shí)踐已經(jīng)證明 此種方法檢測(cè)存在 一定的 缺陷，即 檢測(cè) 所蘭州大學(xué)碩士學(xué)位論文 人腺病毒南京、蘭州、湖南 地方株型別鑒定及 基因序列進(jìn)化 分析 需時(shí)間較長且靈敏度較低。分子生物學(xué)方法主要包括聚合酶鏈反應(yīng)（ 多重 式 光定量 限制性片段多態(tài) 性（ 測(cè)，核酸雜交，原位雜交及時(shí)間分辨免疫熒光技術(shù)等 72， 這些方法使腺病毒的分型方法有了飛躍的改進(jìn)，利用 技術(shù)特異性和靈敏度都大大提高。 圖 人腺病毒分組分型 州大學(xué)碩士學(xué)位論文 人腺病毒南京、蘭州、湖南 地方株型別鑒定及 基因序列進(jìn)化 分析 細(xì)胞培養(yǎng) 目前對(duì)腺病毒 各方面的研究都進(jìn)行得比較深入，其結(jié)構(gòu)簡單，在感染過程中可以產(chǎn)生大量的病毒 研究真核基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制的良好模型，宿主范圍廣泛，感染率高，易于培養(yǎng)和純化。腺病毒可在 肺上皮腺癌細(xì)胞 （ 宮頸癌上皮細(xì)胞（ 人胚腎上皮細(xì)胞（ 人喉癌上皮細(xì)胞（ 上皮細(xì)胞中增殖，并產(chǎn)生特征性的細(xì)胞病變效應(yīng) 70,91 細(xì)胞變大，變圓，腫脹，團(tuán)聚，有時(shí)可有拉絲現(xiàn)象，最突出的表現(xiàn)是許多病變細(xì)胞聚在一起呈葡萄串狀，最后自細(xì)胞培養(yǎng)瓶壁脫落。 在 293T 細(xì)胞繼代 ，出現(xiàn)細(xì)胞病變?cè)缜颐黠@。 293T 細(xì)胞培養(yǎng) 36 小時(shí)后開始出現(xiàn)病變， 76 小時(shí)病變效應(yīng)明顯呈葡萄串狀，而 胞和 胞出現(xiàn) 間相對(duì)較長，一般 48 小時(shí)之后。 上述敏感細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)合成病毒結(jié)構(gòu)蛋白，在細(xì)胞核內(nèi)組裝成完整的病毒顆粒，當(dāng)細(xì)胞完全破碎時(shí)，病毒粒子才能從細(xì)胞中釋放出來。在提取病毒核酸之前，須用凍融裂解細(xì)胞或者超聲波等方法將細(xì)胞震裂。 因特征研究的目的和意義 泛分布于世界各地，傳播非常迅速，通常引起無臨床癥狀的隱形感染，且伴隨著其他 病毒和細(xì)菌的混合感染，對(duì)嬰幼兒和免疫缺陷的患者易感。造成嬰幼兒呼吸道感染最常見的病毒，造成了極大的疾病負(fù)擔(dān) 70,73。清型別較多，近年來發(fā)現(xiàn)新的變異重組血清型越來越多，且重組變異的血清型毒力都遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于原始株。六鄰體 ( 重要的結(jié)構(gòu)蛋白，能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，存在決定血清特異性的抗原決定簇，而這些抗原決定簇主要位于 構(gòu)表面的 個(gè)環(huán)區(qū)。腺病毒中和抗體的產(chǎn)生主要針對(duì)其表面的高變區(qū)（ 31,37,70。近年來全 國各地均有 發(fā) 的報(bào)道，但關(guān)于 因的特點(diǎn)系統(tǒng)性的進(jìn)化分析研究甚少。 主要的結(jié)構(gòu)蛋白，其結(jié)構(gòu)具有特異性，是編碼 要中和抗原參與免疫反應(yīng)的結(jié)構(gòu)，由 發(fā)的中和抗體具有血清特異性。這種血清特異性可能是由 白的氨基酸序列決定的。明確腺病毒各血清型 基因特點(diǎn)，分析不同血清型 白是否發(fā)生變異，具有非常重要的意義。 對(duì) 白結(jié)構(gòu)和功能深入的研究表明，決定血清特異性的抗原決定簇主要存在于 這三 個(gè)環(huán)上 31。 結(jié)構(gòu)包括 個(gè)高變區(qū)，而 結(jié)構(gòu)只有 人腺病毒南京、蘭州、湖南 地方株型別鑒定及 基因序列進(jìn)化 分析 這一高變區(qū)。諸多研究發(fā)現(xiàn)， 構(gòu)存在抗原決定簇，且 99%的異性氨基酸殘基都位于 論文就南京、湖南和蘭州地區(qū)呼吸道標(biāo)本進(jìn)行人腺病毒檢測(cè)，確定南京、湖南和蘭州 流行病學(xué)特征；之后隨機(jī)篩選各個(gè)血清型的陽性標(biāo)本進(jìn)行細(xì)胞分離培養(yǎng)，探究 型的 部核苷酸序列和氨基酸序列，確定南京、湖南和蘭州地區(qū)人腺病毒 因的進(jìn)化特點(diǎn)。 蘭州大學(xué)碩士學(xué)位論文 人腺病毒南京、蘭州、湖南 地方株型別鑒定及 基因序列進(jìn)化 分析 第二章 南京、蘭州和湖南地區(qū)呼吸道感染腺病毒的檢測(cè) 驗(yàn)材料 床標(biāo)本及采集方法 南京和湖南 2010 年 8 月 7 月 、蘭州 2009 年 12 月 11 因呼吸道感染在南京 市 兒童醫(yī)院、蘭州大學(xué)第一醫(yī)院 兒科 和湖南省人民醫(yī)院兒內(nèi)科住院和門診的兒童。對(duì) 3530 例住院和門診患兒進(jìn)行鼻咽抽吸 物的采集，用連接負(fù)壓吸引器無菌吸痰管經(jīng)鼻腔插入 7到咽部以下，負(fù)壓吸取鼻咽部分泌物1入 2毒保存液（含有 1%的谷氨酰胺， 5%雙抗），置于 低溫冰箱保存至檢測(cè)。 劑 毒 量提取試劑盒（德國 司） 合酶（大連 司） M 逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒（美國 司） 2.5 10 大連 司） L 100（大連 司） 膠回收試劑盒 國 司） 瓊脂糖（ 美國 司） 國 司） 體（美國 司） 連 司） 大腸桿菌 受態(tài)細(xì)胞大連 司） 器和設(shè)備 電子天平（德國 司） 熱恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科技有限公司） 熱恒溫水浴鍋（北京長風(fēng)儀器儀表公司） 水平式瓊脂糖凝膠電泳儀（北京六一儀器廠） （德國 司） 渦混合器（上海隆拓儀器設(shè)備有限公司） 蘭州大學(xué)碩士學(xué)位論文 人腺病毒南京、蘭州、湖南 地方株型別鑒定及 基因序列進(jìn)化 分析 養(yǎng)箱（日本 司） 倒置顯微鏡，顯微鏡攝像系統(tǒng)（日本 司） 二級(jí)生物安全柜（美國 司） 紫外照射儀（美國博朗特公司） 量加樣槍 （德國 司） 國 司） 驗(yàn)方法 本的處理 將標(biāo)本于 37 恒溫水浴鍋中充分溶解，高速旋渦振蕩至水樣，不粘稠，再于超凈臺(tái)中分裝到 中，根據(jù)標(biāo)本量的不同分裝到不同數(shù)量的 中。利用高速低溫離心機(jī)調(diào)至溫度 4 ，轉(zhuǎn)速 3700心 5 分鐘。離心后取上清液，按 200l 分別分裝至 中，剩余上清分裝 1 200存 用。 本病毒核酸的提取 采用 劑盒提取 人 腺病毒 體方法如下： (1) 將 25白酶（或者蛋白酶 K）加入含有 200l 中（ 200l 標(biāo)本從 冰箱取出后常溫融化）； (2) 加入 200l L，高速旋渦振蕩 15 秒； (3) 56 水浴 15 分鐘，在恒溫水浴箱內(nèi)進(jìn)行； (4) 水浴結(jié)束后， 5000 6000暫離心 5 6 秒 （將 沾于管口和管壁的液體離心至管底 ） ； (5) 加入 200l 無水乙醇（ 96% 100%），漩渦振蕩 15 秒， 5000 6000 5 6 秒，將沾于管口和管壁的液體離心至管底； (6) 將步驟 (5)中液體輕柔地轉(zhuǎn)移到離心柱中， 8000心 1 分鐘，棄收集管內(nèi)液體，換新的收集管； (7) 在離心柱中加入 500l 加過無水乙醇）， 8000 心 1分鐘，棄收集管中廢液，換新的收集管子； (8) 加入 500l 加過無水乙醇）， 14000 心 3 分鐘，棄收集管中廢液； (9) 將離心柱置于新的收集管中， 14000 離 1 分鐘 ； 蘭州大學(xué)碩士學(xué)位論文 人腺病毒南京、蘭州、湖南 地方株型別鑒定及 基因序列進(jìn)化 分析 (10) 將離心柱置入干凈的 P 管中，加入 50l E，室溫靜置 1分鐘， 8000 心 1 分鐘，洗脫核酸腺病毒核酸 (11) 將 30l 的 裝成 5l 每管（ 保存于 ，以備后續(xù)試驗(yàn)使用。 要溶液的配制 (1) 養(yǎng)基：酵母提取物 5 g、 0 g，胰蛋白胨 10 g，加 到 容至 1000 進(jìn)行高壓蒸汽滅菌， 4 保存。 (2) 脂培養(yǎng)平板：取 1.0 g 瓊脂粉加入到 100 B 培養(yǎng) 基中，高壓蒸汽滅菌，待冷卻至 37 左右時(shí)，加入濃度為 200mg/ 液，使終濃度為 100 g/培養(yǎng)基倒入平皿中，待其自然凝固后， 4 保存。 (3)1%瓊脂糖凝膠：取瓊脂糖粉 170沖液，在微波爐中火加熱 3瓊脂粉充分溶解，加 5酸染料 (4)50 泳緩沖液：將 242入到 950去離子水中，待充分溶解后，加入 醋酸和 加水定容至1000 腺病毒 增鑒定 對(duì) 3530 份呼吸道標(biāo)本腺病毒的核酸 行了 增鑒定 46,77,81。 表 2人腺病毒 增引物 引物名稱 核酸序列 目的片段的長度（ 88 88 21 21 第一輪反應(yīng)總體系： 25l 10 2l 0M) 1l 0M) 1l 蘭州大學(xué)碩士學(xué)位論文 人腺病毒南京、蘭州、湖南 地方株型別鑒定及 基因序列進(jìn)化 分析 合酶 板 5l 二輪反應(yīng)總體系： 25l 10 2l 0M) 1l 0M) 1l 合酶 一輪的 物 1l 輪反應(yīng)條件相同： 94 54 30s 52 30s 352 22 5預(yù)變性溫度 94 ， 3性 94 ， 30s；退火溫度 52 ， 30s；延伸溫度 72 ， 2火溫度可以根據(jù)適當(dāng)調(diào)整，是擴(kuò)增產(chǎn)物濃度提高，電泳鑒定條帶更亮。兩輪從變性到延伸循環(huán) 35 個(gè)循環(huán)。 增產(chǎn)物的膠回收及 T 載體的連接 取 5物與 1l6合物在含 2% 1%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測(cè)， 160V 電泳 20 分鐘，電泳鑒定陽性標(biāo)本直接送測(cè)序。弱陽性標(biāo)本再用原來的 增條件但體系加倍即總體系量（ 50增，擴(kuò)增產(chǎn)物再次使用 1%的瓊脂糖凝膠電泳，在長波紫外燈光下切下含有目的條帶的凝膠，隨后利用德國 司的膠回收試劑盒（ 行膠回收。具體操作如下： (1) 將 10要回收的 物混合，加入 脂糖凝膠模板，同時(shí)加入 100流電壓 120V，電泳約 20 分鐘； (2) 在長波紫外燈光下，切下目的條帶放入 中； (3) 在 中加入產(chǎn)物凝膠 3 倍重量的 分震蕩后置于 50 恒溫水浴鍋中水浴 10凝膠可以完全溶解（期間每 2蕩一次）； 蘭州大學(xué)碩士學(xué)位論文 人腺病毒南京、蘭州、湖南 地方株型別鑒定及 基因序列進(jìn)化 分析 (4) 如果 目的條帶 4，加入 100l 異丙醇混勻； (5) 將上述 中液體轉(zhuǎn)移至離心柱中， 14000心 1 分鐘，棄收集管中濾液（如果凝膠溶液體積大于 650l，可重復(fù)進(jìn)行此步驟）； (6) 加入 過無水乙醇） 750l，室溫下靜置 5 分鐘； (7) 14000心 1 分鐘，棄收集管中濾液； (8) 空離 75 秒，將離心柱移到干凈 中，加入 30置 2 分鐘， 14000心 1脫膠回收產(chǎn)物。將回收好的 入 冰箱保存，備用。 膠回收產(chǎn)物通過 接酶連接到 體， 4 過夜，連接的具體操作如下： (1) 在 中加入 2連接緩沖液 體 回收產(chǎn) 物 勻； (2) 短暫離心后封口膠封口， 4 過夜。 接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化 將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌 受態(tài)細(xì)胞（大連 司），挑 3液送測(cè)序。轉(zhuǎn)化具體操作過程如下： (1) 分裝 25 30受態(tài)細(xì)胞于 中，加入 5l 連接 產(chǎn)物，混勻； (2) 冰中放置 30 分鐘； (3) 42 水浴 90 秒（時(shí)間應(yīng)嚴(yán)格 90s），快速轉(zhuǎn)至冰上； (4) 冰浴 2 分鐘； (5) 加入 100l 無氨芐青霉素的 養(yǎng)基； (6) 在搖箱中 37 150蕩 1 小時(shí)，將菌液均勻涂布于含 500ug/芐青霉 素的 板（已均勻涂布 1650mg/ 8200mg/上，置于 37 培養(yǎng)箱中 14 16 小時(shí)。 蘭州大學(xué)碩士學(xué)位論文 人腺病毒南京、蘭州、湖南 地方株型別鑒定及 基因序列進(jìn)化 分析 克隆及搖菌 在已出現(xiàn)藍(lán)白斑的平板上選取生長良好的白色單菌落，接種于 2氨芐青霉素（ 100ug/液體 養(yǎng)基中， 37 劇烈震蕩 12 小時(shí)。取 300 500 圖 2通 序峰圖 計(jì)學(xué)方法 采用 行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，計(jì)量資料采用均數(shù) 標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組之間率的差別使用 2 檢驗(yàn)或者 切概率法 ，兩組之間均數(shù)的比較或幾何均數(shù) 549 例患兒門診患兒164 例，住院患兒 385 例，門診患兒和住院患兒人腺病毒檢出率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ 的患兒人腺病毒檢出率較低?？v向看下面三個(gè)圖均可顯示 12通過統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分別比較南京、蘭州和湖 南 3 歲患兒與 3 歲的患兒，人腺病毒檢出率差異性無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P 圖 2南京 2010人腺病毒陽性患兒年齡分布 蘭州大學(xué)碩士學(xué)位論文 人腺病毒南京、蘭州、湖南 地方株型別鑒定及 基因序列進(jìn)化 分析 圖 2南 2010人腺病毒陽性患兒年齡分布 圖 2州 2009人腺病毒陽性患兒年齡分布 京 、 湖南 和 蘭州 腺病毒陽性患兒的季節(jié)分布 將 549 份人腺病毒檢測(cè)檢出的陽性數(shù)、標(biāo)本總數(shù)及檢出率按三個(gè)地區(qū)分別進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，南京 4 月份和 12 月份檢出率出現(xiàn)兩個(gè)小高峰， 蘭州 4 月份出現(xiàn)一個(gè)高峰，而湖南則是 5 月和 7 月出現(xiàn) 人 腺病毒感染高 峰， 統(tǒng)計(jì)學(xué) 分析南京、湖南和蘭州三個(gè)地區(qū)人腺病毒感染無明顯季節(jié)性。 蘭州大學(xué)碩士學(xué)位論文 人腺病毒南京、蘭州、湖南 地方株型別鑒定及 基因序列進(jìn)化 分析 圖 2南京 2010人腺病毒陽性患兒季節(jié)分布 圖 2南 2010人腺病毒陽性患兒季節(jié)分布 蘭州大學(xué)碩士學(xué)位論文 人腺病毒南京、蘭州、湖南 地方株型別鑒定及 基因序列進(jìn)化 分析 圖 2蘭州 2009人腺病毒陽性患兒季節(jié)分布 京、 湖南和蘭州 地區(qū)腺病毒陽性的分型結(jié)果 南京、 湖南 和 蘭州 性標(biāo)本的分型結(jié)果顯示 主要流行株，分別占各地區(qū)檢出率的 62%， 80%， 81%。 屬于人腺病毒 B 組， B 組少見的血清型 別在湖南和南京也有檢出。其他血清型 也在三個(gè)地區(qū)不同程度檢出，但檢出率相對(duì)較低。 圖 2南京腺病毒陽性標(biāo)本分型結(jié)果 蘭州大學(xué)碩士學(xué)位論文 人腺病毒南京、蘭州、湖南 地方株型別鑒定及 基因序列進(jìn)化 分析 圖 2湖南腺病毒陽性標(biāo)本分型結(jié)果 圖 2蘭州腺病毒陽性標(biāo)本分型結(jié)果 論 急性呼吸道感染（ 引起全世界兒童最常見的疾病，是導(dǎo)致小于 5 歲兒童發(fā)病和死亡的主要原因之一。 主要病因即為病毒，主要包括呼吸道合胞病毒（ 人腺病毒（ 鼻病毒（ 流感病毒（ 副流感病毒（ 人偏肺病毒（ 都是最主要的引起呼吸道癥狀的病毒74。以往的流行病學(xué)資料表明，人腺病毒多感染 5 歲以下兒童，尤其 2 歲以內(nèi)的兒童發(fā) 病率最高 78,82。 關(guān)呼吸道感染非常常見，大約 5%童上蘭州大學(xué)碩士學(xué)位論文 人腺病毒南京、蘭州、湖南 地方株型別鑒定及 基因序列進(jìn)化 分析 呼吸道感染和 5%下呼吸道感染是由然腺病毒感染導(dǎo)致的 78。人腺病毒引起的急性呼吸道感染可全年散發(fā)，大多數(shù)研究報(bào)道無明顯的季節(jié)性 3,6,8，也有報(bào)道冬春季多發(fā) 21,24。作為