1、 基因工程操作的一般步驟基因工程操作的一般步驟 1 1、目的基因獲得：取得編碼人們目標(biāo)性狀要求的、目的基因獲得：取得編碼人們目標(biāo)性狀要求的DNADNA片段片段即基因；即基因； 2 2、目的基因克?。◤?fù)制）與驗(yàn)證、目的基因克隆（復(fù)制）與驗(yàn)證 3 3、目的基因表達(dá)載體構(gòu)建：將目的基因與質(zhì)粒載體或病、目的基因表達(dá)載體構(gòu)建：將目的基因與質(zhì)粒載體或病毒載體連接成能夠在生物中表達(dá)的重組毒載體連接成能夠在生物中表達(dá)的重組 DNADNA； 4 4、轉(zhuǎn)化：把重組、轉(zhuǎn)化：把重組DNADNA引入某種受體生物或細(xì)胞；引入某種受體生物或細(xì)胞； 5 5、篩選：從大量的受體中篩選出可能具有目的基因的個(gè)、篩選：從大量的受體中

2、篩選出可能具有目的基因的個(gè)體或細(xì)胞挑選出來。體或細(xì)胞挑選出來。 第三節(jié)第三節(jié) 基因工程上游技術(shù)基因工程上游技術(shù)基因片段的獲得、驗(yàn)證和表達(dá)載體構(gòu)建基因片段的獲得、驗(yàn)證和表達(dá)載體構(gòu)建為體外為體外DNADNA重組，一般認(rèn)為是基因工程的重組，一般認(rèn)為是基因工程的上上游技術(shù)；游技術(shù)；轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)化體篩選主要是進(jìn)行目的基因轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)化體篩選主要是進(jìn)行目的基因向目標(biāo)生物體內(nèi)的轉(zhuǎn)移、體內(nèi)重組和重組向目標(biāo)生物體內(nèi)的轉(zhuǎn)移、體內(nèi)重組和重組體篩選鑒定，稱為基因工程的體篩選鑒定，稱為基因工程的下游技術(shù)。下游技術(shù)。 目的基因片段獲得目的基因片段獲得克隆載體克隆載體( (空空) )目的基因克隆載體目的基因克隆載體基因克隆驗(yàn)證基因

3、克隆驗(yàn)證切出片段切出片段插入片段測序驗(yàn)證插入片段測序驗(yàn)證NY表達(dá)載體表達(dá)載體( (空空) )目的基因表達(dá)載體目的基因表達(dá)載體表達(dá)載體驗(yàn)證表達(dá)載體驗(yàn)證N表達(dá)載體表達(dá)載體構(gòu)建構(gòu)建Y基因片段獲得基因片段獲得Y導(dǎo)入工程菌或病毒導(dǎo)入工程菌或病毒直接轉(zhuǎn)化直接轉(zhuǎn)化介導(dǎo)生物驗(yàn)證介導(dǎo)生物驗(yàn)證YN生物介導(dǎo)轉(zhuǎn)化生物介導(dǎo)轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化目的基因DNA檢測目的基因RNA檢測目的Protein檢測Protein 活性檢測室內(nèi)室內(nèi)田間功能驗(yàn)證田間功能驗(yàn)證受體抗性篩選受體抗性篩選YNN篩選篩選一一、目的基因的獲得、目的基因的獲得1 1、目的基因、目的基因基因工程中用來改造生物個(gè)體或用于生產(chǎn)某種產(chǎn)物的有用基因?；蚬こ讨杏脕砀脑焐?/p>

4、物個(gè)體或用于生產(chǎn)某種產(chǎn)物的有用基因。2 2、目的基因獲得方法、目的基因獲得方法 （1）化學(xué)合成法：按照預(yù)先設(shè)計(jì)的化學(xué)合成法：按照預(yù)先設(shè)計(jì)的DNADNA序列，通過化學(xué)反應(yīng)合成目的序列，通過化學(xué)反應(yīng)合成目的基因片段的方法?；蚱蔚姆椒ā?合成方向：合成方向：3-53-5 合成長度：合成長度：10-500bp10-500bp 優(yōu)點(diǎn)：目的性強(qiáng)，商業(yè)化程度高、自動化程度較高優(yōu)點(diǎn)：目的性強(qiáng)，商業(yè)化程度高、自動化程度較高 缺點(diǎn)：合成長度有限，設(shè)備昂貴缺點(diǎn)：合成長度有限，設(shè)備昂貴乙腈亞磷酸胺化學(xué)合成法乙腈亞磷酸胺化學(xué)合成法Step1：對在擔(dān)體上的第一個(gè)堿基進(jìn)行脫保護(hù)（：對在擔(dān)體上的第一個(gè)堿基進(jìn)行脫保護(hù)（DM

5、Tr基）基） 反應(yīng)，用以準(zhǔn)備附加下一個(gè)新的堿基。反應(yīng)，用以準(zhǔn)備附加下一個(gè)新的堿基。 Step2：活化新的堿基，準(zhǔn)備和前一個(gè)堿基進(jìn)行反應(yīng)。：活化新的堿基，準(zhǔn)備和前一個(gè)堿基進(jìn)行反應(yīng)。 Step3：第二個(gè)堿基附加反應(yīng)到第一個(gè)堿基上。：第二個(gè)堿基附加反應(yīng)到第一個(gè)堿基上。 Step4：把第一個(gè)堿基沒有和第二個(gè)堿基反應(yīng)上的部分（反：把第一個(gè)堿基沒有和第二個(gè)堿基反應(yīng)上的部分（反應(yīng)失敗部分）加帽封死（應(yīng)失敗部分）加帽封死（Capping反應(yīng)反應(yīng))，不讓其進(jìn)行進(jìn)一，不讓其進(jìn)行進(jìn)一步延伸反應(yīng)。步延伸反應(yīng)。 Step5：對第二個(gè)堿基和第一個(gè)堿基的連接部分進(jìn)行氧化反：對第二個(gè)堿基和第一個(gè)堿基的連接部分進(jìn)行氧化反應(yīng)，使

6、應(yīng)，使3價(jià)磷變成價(jià)磷變成5價(jià)磷，使合成產(chǎn)物變得更加穩(wěn)定。如需價(jià)磷，使合成產(chǎn)物變得更加穩(wěn)定。如需進(jìn)一步合成延伸堿基時(shí)，再回到進(jìn)一步合成延伸堿基時(shí)，再回到Step1進(jìn)行合成。如此循環(huán)進(jìn)行合成。如此循環(huán)往復(fù)，可以不斷合成往復(fù)，可以不斷合成DNA堿基，直至合成完所需序列堿基，直至合成完所需序列 Step6：從：從CPG擔(dān)體上用氨水切離合成終了的擔(dān)體上用氨水切離合成終了的Oligo DNA。（2 2） PCRPCR法：參照已知基因序列，在該基因序列法：參照已知基因序列，在該基因序列保守區(qū)域設(shè)計(jì)兩個(gè)引物，用保守區(qū)域設(shè)計(jì)兩個(gè)引物，用PCRPCR反應(yīng)獲得兩個(gè)反應(yīng)獲得兩個(gè)引物之間該基因引物之間該基因DNADNA

7、序列的方法。序列的方法。 引物來源：已知基因序列引物來源：已知基因序列 片段獲得：片段獲得：PCRPCR 優(yōu)點(diǎn)：操作容易、目的性強(qiáng)優(yōu)點(diǎn)：操作容易、目的性強(qiáng) 缺點(diǎn)：不能克隆未知基因或序列同源性較缺點(diǎn)：不能克隆未知基因或序列同源性較差的基因，含內(nèi)含子差的基因，含內(nèi)含子 (3)RT-PCR (3)RT-PCR法：參照已知基因序列，在該基因序法：參照已知基因序列，在該基因序列保守區(qū)域設(shè)計(jì)兩個(gè)引物，用列保守區(qū)域設(shè)計(jì)兩個(gè)引物，用PCRPCR反應(yīng)獲得兩個(gè)引反應(yīng)獲得兩個(gè)引物之間該基因編碼序列物之間該基因編碼序列(mRNA)(mRNA)的方法。的方法。 引物來源：已知基因序列引物來源：已知基因序列 片段獲得：片

8、段獲得：RT-PCRRT-PCR 優(yōu)點(diǎn)：操作容易、目的性強(qiáng)優(yōu)點(diǎn)：操作容易、目的性強(qiáng) 缺點(diǎn)：不能克隆未知基因或序列同源性較差的基因缺點(diǎn)：不能克隆未知基因或序列同源性較差的基因（4 4）基因組文庫法：將基因組）基因組文庫法：將基因組DNADNA切割成片段后切割成片段后，直接克隆構(gòu)建成基因組文庫，從基因組文庫中，直接克隆構(gòu)建成基因組文庫，從基因組文庫中查找有用克隆的編碼序列的方法。查找有用克隆的編碼序列的方法。 片段切割：識別序列為片段切割：識別序列為4 4堿基的限制性內(nèi)切酶堿基的限制性內(nèi)切酶 克隆載體：病毒、噬菌體、酵母人工染色體克隆載體：病毒、噬菌體、酵母人工染色體 優(yōu)點(diǎn)：能夠獲得未知基因，能夠

9、對基因組所有基因進(jìn)行研究優(yōu)點(diǎn)：能夠獲得未知基因，能夠?qū)蚪M所有基因進(jìn)行研究 缺點(diǎn)缺點(diǎn): :序列含內(nèi)含子序列含內(nèi)含子, ,基因通用性較差基因通用性較差 （5）cDNAcDNA文庫法：以生物體內(nèi)文庫法：以生物體內(nèi)mRNAmRNA合成合成cDNAcDNA后直接克隆構(gòu)建成后直接克隆構(gòu)建成cDNAcDNA文庫，從中查找有用基因的文庫，從中查找有用基因的方法。方法。 片段來源：片段來源：mRNAmRNA逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄 克隆載體：質(zhì)粒載體克隆載體：質(zhì)粒載體 優(yōu)點(diǎn)：便于獲得表達(dá)的基因的序列，獲得得優(yōu)點(diǎn)：便于獲得表達(dá)的基因的序列，獲得得序列為編碼序列無內(nèi)含子，費(fèi)用較低序列為編碼序列無內(nèi)含子，費(fèi)用較低 缺點(diǎn)：無法

10、獲得未表達(dá)或表達(dá)水平較低基因缺點(diǎn)：無法獲得未表達(dá)或表達(dá)水平較低基因 （六）T-DNA標(biāo)簽法（七）mRNA差異顯示法（八）反向克隆法二、目的基因的克隆二、目的基因的克隆在獲得了目的基因片段后，為了在獲得了目的基因片段后，為了便于下一步操作，常需將該片段克隆便于下一步操作，常需將該片段克隆到克隆載體上，進(jìn)行大量復(fù)制，并驗(yàn)到克隆載體上，進(jìn)行大量復(fù)制，并驗(yàn)證該片段序列是否正確。證該片段序列是否正確。 ( (一一) )克隆定義：克隆定義：1 1克隆克隆( (名詞名詞) )：通過無性繁殖形成的與其：通過無性繁殖形成的與其親本一致的生物群體。親本一致的生物群體。2 2克隆克隆( (動詞動詞) )：生物的無性

11、繁殖。：生物的無性繁殖。3. 3. 基因克?。簩⒛康幕蚱芜B接到克隆基因克隆：將目的基因片段連接到克隆載體上并進(jìn)行大量復(fù)制的過程。載體上并進(jìn)行大量復(fù)制的過程。 ( (二二) )基因克隆步驟基因克隆步驟1 1、目的基因片段的獲得：、目的基因片段的獲得：PCRPCR、酶切獲得、酶切獲得2 2、目的基因片段的分離純化：、目的基因片段的分離純化： 電泳：分離電泳：分離 回收：從膠內(nèi)提取、純化并定量?；厥眨簭哪z內(nèi)提取、純化并定量。3 3、目的基因片段與克隆載體連接：、目的基因片段與克隆載體連接： 平末端連接：平末端酶酶切獲得的或粘末端經(jīng)補(bǔ)平后的片段的平末端連接：平末端酶酶切獲得的或粘末端經(jīng)補(bǔ)平后的片段

12、的連接。連接。 粘末端連接：粘末端酶酶切后獲得的片段的連接。粘末端連接：粘末端酶酶切后獲得的片段的連接。 T/AT/A克?。航?jīng)常規(guī)克隆：經(jīng)常規(guī)PCRPCR反應(yīng)獲得的片段的連接。反應(yīng)獲得的片段的連接。4 4、目的基因片段重組克隆載體篩選驗(yàn)證、目的基因片段重組克隆載體篩選驗(yàn)證5 5、目的基因片段復(fù)制(三三)基因基因重組克隆重組克隆篩選篩選 將已經(jīng)連接外源基因的載體將已經(jīng)連接外源基因的載體(DNA)(DNA)向受體生物向受體生物細(xì)胞中導(dǎo)入，從大量的受體中篩選出成功導(dǎo)入目細(xì)胞中導(dǎo)入，從大量的受體中篩選出成功導(dǎo)入目的基因克隆載體的個(gè)體，稱的基因克隆載體的個(gè)體，稱為重組克隆篩選為重組克隆篩選。 一般克隆載

13、體的受體生物為大腸桿菌。常用一般克隆載體的受體生物為大腸桿菌。常用的篩選方法有兩種：的篩選方法有兩種： 1 1、抗生素抗性篩選、抗生素抗性篩選 2 2、菌落藍(lán)、白斑篩選、菌落藍(lán)、白斑篩選 pUC19篩選結(jié)果模式圖(四四)載體上載體上插入基因片段的驗(yàn)證插入基因片段的驗(yàn)證1 1、DNADNA酶切法酶切法 2 2、PCRPCR法法3 3、DNADNA測序法測序法 模板模板+dNTP+測序引物測序引物+測序測序Taq酶酶ddATPddTTPddGTPddCTP三、目的基因的表達(dá)載體構(gòu)建三、目的基因的表達(dá)載體構(gòu)建 目的基因片段經(jīng)驗(yàn)證正確后，需構(gòu)建適合于受目的基因片段經(jīng)驗(yàn)證正確后，需構(gòu)建適合于受體生物的基

14、因表達(dá)載體。體生物的基因表達(dá)載體。 表達(dá)載體的構(gòu)建過程就是把目的基因的閱讀框表達(dá)載體的構(gòu)建過程就是把目的基因的閱讀框架架(編碼序列編碼序列)插入適宜的表達(dá)載體插入適宜的表達(dá)載體(空空)的啟動子、終的啟動子、終止子中間，形成表達(dá)框架。止子中間，形成表達(dá)框架。 表達(dá)框架：表達(dá)框架：啟動子啟動子-目的基因的目的基因的ORF-終止子終止子 1 1、表達(dá)載體的作用：表達(dá)載體的作用：使該基因能夠被使該基因能夠被導(dǎo)入新的生物體、進(jìn)行自主或整合復(fù)制并導(dǎo)入新的生物體、進(jìn)行自主或整合復(fù)制并在生物體中啟動和表達(dá)。在生物體中啟動和表達(dá)。 一般情況下有三個(gè)串聯(lián)的表達(dá)框架：一般情況下有三個(gè)串聯(lián)的表達(dá)框架：-1-2-3-

15、1、啟動子、啟動子-抗性基因的抗性基因的ORF-終止子終止子 2、啟動子啟動子-目的基因的目的基因的ORF-終止子終止子 3、啟動子、啟動子-報(bào)告基因的報(bào)告基因的ORF-終止子終止子抗性基因：抗性基因：Npt II：新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因，抗卡那霉素新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因，抗卡那霉素 Hyg: 潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因, ,抗潮霉素抗潮霉素 gentR:慶大霉素抗性慶大霉素抗性 基因基因，抗慶大霉素抗慶大霉素 AmpAmpR:氨芐青霉素抗性基因，抗青霉素類氨芐青霉素抗性基因，抗青霉素類 TETR:四環(huán)素抗性基因四環(huán)素抗性基因,抗四環(huán)素抗四環(huán)素報(bào)告基因：報(bào)告基因：Gus:催化溴取代葡

16、萄糖轉(zhuǎn)化無色催化溴取代葡萄糖轉(zhuǎn)化無色-藍(lán)色反應(yīng)藍(lán)色反應(yīng) Gfp:綠色熒光蛋白，合成綠色熒光蛋白綠色熒光蛋白，合成綠色熒光蛋白 Lac（z）:催化溴取代半乳糖無色催化溴取代半乳糖無色-藍(lán)色轉(zhuǎn)化反應(yīng)藍(lán)色轉(zhuǎn)化反應(yīng)常用選擇標(biāo)記常用選擇標(biāo)記(編碼基因編碼基因):2 2、生物表達(dá)系統(tǒng)的特異性、生物表達(dá)系統(tǒng)的特異性 不同生物中，啟動基因的表達(dá)需要不同的啟不同生物中，啟動基因的表達(dá)需要不同的啟動子，在原核生物中，需要原核生物啟動子和終止動子，在原核生物中，需要原核生物啟動子和終止子；在植物中，需要適合植物的啟動子和終止子。子；在植物中，需要適合植物的啟動子和終止子。 在原核生物中，經(jīng)常使用的啟動子有：在原核生

17、物中，經(jīng)常使用的啟動子有：T3T3、T7T7和和SP6SP6啟動子。啟動子。 在植物中，經(jīng)常使用的啟動子有：在植物中，經(jīng)常使用的啟動子有：CaMV 35SCaMV 35S啟啟動子，胭脂堿合成酶基因終止子。動子，胭脂堿合成酶基因終止子。 3 3、植物表達(dá)載體系統(tǒng)、植物表達(dá)載體系統(tǒng)目前常用的植物表達(dá)載體系統(tǒng)有：目前常用的植物表達(dá)載體系統(tǒng)有： 1、質(zhì)粒載體系統(tǒng)：、質(zhì)粒載體系統(tǒng)： 2、病毒載體系統(tǒng)：、病毒載體系統(tǒng)：根癌農(nóng)桿菌及其質(zhì)粒Ti質(zhì)粒Vir:毒區(qū)，切割、轉(zhuǎn)運(yùn)、侵染區(qū)毒區(qū)，切割、轉(zhuǎn)運(yùn)、侵染區(qū) T-DNA區(qū)：被轉(zhuǎn)移整合到植物的區(qū)：被轉(zhuǎn)移整合到植物的DNA區(qū)域區(qū)域LB:左邊界左邊界 RB：右邊界：右邊

18、界 把目的基因表達(dá)框架整合到改造后的把目的基因表達(dá)框架整合到改造后的Ti質(zhì)質(zhì)粒粒( (卸甲質(zhì)粒卸甲質(zhì)粒) )的的T-DNAT-DNA區(qū)域形成的質(zhì)粒載體。區(qū)域形成的質(zhì)粒載體。 所有基因轉(zhuǎn)移、基因表達(dá)元件位于同一質(zhì)所有基因轉(zhuǎn)移、基因表達(dá)元件位于同一質(zhì)粒上，稱為一元表達(dá)載體。但這類載體構(gòu)建困粒上，稱為一元表達(dá)載體。但這類載體構(gòu)建困難，目的基因整合概率較低。難，目的基因整合概率較低。 改造改造TiTi質(zhì)粒：取代致瘤和不必要的基因。質(zhì)粒：取代致瘤和不必要的基因。 1 1）一元載體系統(tǒng)（整合載體系統(tǒng)）一元載體系統(tǒng)（整合載體系統(tǒng)）Ti質(zhì)粒Vir:區(qū)區(qū):環(huán)化成輔助質(zhì)粒環(huán)化成輔助質(zhì)粒T-DNA區(qū)：環(huán)化成微型區(qū)：

19、環(huán)化成微型Ti-質(zhì)粒質(zhì)粒 它由微型它由微型Ti質(zhì)粒（質(zhì)粒（mini-Ti plasmid）和輔助）和輔助Ti質(zhì)粒質(zhì)粒（helper Ti plasmid）兩個(gè)獨(dú)立的質(zhì)）兩個(gè)獨(dú)立的質(zhì)粒粒構(gòu)成。構(gòu)成。 輔助質(zhì)粒：輔助質(zhì)粒： 提供提供Vir基因的轉(zhuǎn)移、切割、拼接功能基因的轉(zhuǎn)移、切割、拼接功能 微型微型Ti質(zhì)粒：含有質(zhì)粒：含有T-DNA邊界、為一個(gè)廣譜質(zhì)粒，提供用邊界、為一個(gè)廣譜質(zhì)粒，提供用于轉(zhuǎn)移的基因表達(dá)框架。于轉(zhuǎn)移的基因表達(dá)框架。 2 2）雙元載體系統(tǒng)）雙元載體系統(tǒng)binary vectorbinary vector(三三)構(gòu)建過程構(gòu)建過程1 1片段獲得：酶切法片段獲得：酶切法2 2表達(dá)載體線性化

20、：酶切法表達(dá)載體線性化：酶切法3 3、片段分離純化：電泳、條帶回收、片段分離純化：電泳、條帶回收4 4連接：基因片段和載體連接：基因片段和載體DNADNA定向定向連接。連接。 (四四)表達(dá)載體驗(yàn)證表達(dá)載體驗(yàn)證標(biāo)記基因篩選標(biāo)記基因篩選 酶切鑒定法酶切鑒定法 PCRPCR鑒定法鑒定法DNADNA雜交：斑點(diǎn)雜交、菌落原位雜交雜交：斑點(diǎn)雜交、菌落原位雜交。( (五五) )工程菌構(gòu)建工程菌構(gòu)建 表達(dá)載體：直接轉(zhuǎn)化。表達(dá)載體：直接轉(zhuǎn)化。 工程菌構(gòu)建：生物介導(dǎo)轉(zhuǎn)化。把表達(dá)載體轉(zhuǎn)入介導(dǎo)生物中。工程菌構(gòu)建：生物介導(dǎo)轉(zhuǎn)化。把表達(dá)載體轉(zhuǎn)入介導(dǎo)生物中。一、基因轉(zhuǎn)移一、基因轉(zhuǎn)移 把外源把外源DNADNA導(dǎo)入生物體，使生

21、物體發(fā)生某導(dǎo)入生物體，使生物體發(fā)生某種變化的過程稱為轉(zhuǎn)化種變化的過程稱為轉(zhuǎn)化(Transformation)(Transformation)。 把一種生物的基因?qū)氲搅硗庖粋€(gè)生物把一種生物的基因?qū)氲搅硗庖粋€(gè)生物體內(nèi)的過程稱為基因轉(zhuǎn)移體內(nèi)的過程稱為基因轉(zhuǎn)移(gene transfer)(gene transfer)。第四節(jié)第四節(jié) 基因工程下游技術(shù)基因工程下游技術(shù)（一）植物受體系統(tǒng)（一）植物受體系統(tǒng)受體受體: :用于接收外源基因片段的用于接收外源基因片段的生物個(gè)體、細(xì)胞或者組織。生物個(gè)體、細(xì)胞或者組織。 1 1、植物組織：、植物組織： 2 2、原生質(zhì)體：、原生質(zhì)體： 3 3、生殖細(xì)胞：、生殖細(xì)胞

22、： 1 1、植物組織：、植物組織：受傷的細(xì)胞容易受到病毒或質(zhì)粒的感染。這受傷的細(xì)胞容易受到病毒或質(zhì)粒的感染。這些病毒或質(zhì)粒上的某些些病毒或質(zhì)粒上的某些DNADNA通過各種不同的方式轉(zhuǎn)移通過各種不同的方式轉(zhuǎn)移到受傷的植物細(xì)胞，并形成愈傷組織。愈傷組織可到受傷的植物細(xì)胞，并形成愈傷組織。愈傷組織可以培養(yǎng)成完整的轉(zhuǎn)化植株。以培養(yǎng)成完整的轉(zhuǎn)化植株。該受體系統(tǒng)轉(zhuǎn)化率高，可獲得較多的轉(zhuǎn)化植該受體系統(tǒng)轉(zhuǎn)化率高，可獲得較多的轉(zhuǎn)化植株，取材廣泛、適用性廣。但再生植株無性系變異株，取材廣泛、適用性廣。但再生植株無性系變異較大，轉(zhuǎn)化的外源基因穩(wěn)定性差，嵌合體多。較大，轉(zhuǎn)化的外源基因穩(wěn)定性差，嵌合體多。 2 2、原生

23、質(zhì)體：、原生質(zhì)體： 原生質(zhì)體是植物細(xì)胞除去細(xì)胞壁后的部分，是原生質(zhì)體是植物細(xì)胞除去細(xì)胞壁后的部分，是一個(gè)質(zhì)膜包圍的一個(gè)質(zhì)膜包圍的“裸露細(xì)胞裸露細(xì)胞”。 原生質(zhì)體在合適的條件下具有分化、繁殖并再原生質(zhì)體在合適的條件下具有分化、繁殖并再生成完整植株的能力，具有全能性。生成完整植株的能力，具有全能性。 原生質(zhì)體比較容易完成一系列細(xì)胞操作或遺傳原生質(zhì)體比較容易完成一系列細(xì)胞操作或遺傳操作，而且還可以直接高效的捕獲外源基因。操作，而且還可以直接高效的捕獲外源基因。 嵌合體少，遺傳穩(wěn)定性更差，培養(yǎng)周期長，難嵌合體少，遺傳穩(wěn)定性更差，培養(yǎng)周期長，難度大，再生頻率低。度大，再生頻率低。3 3、生殖細(xì)胞：、生殖

24、細(xì)胞： 是以植物生殖細(xì)胞如：花粉細(xì)胞、卵細(xì)胞是以植物生殖細(xì)胞如：花粉細(xì)胞、卵細(xì)胞為受體細(xì)胞進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化的系統(tǒng)。為受體細(xì)胞進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化的系統(tǒng)。 目前主要以兩個(gè)途徑利用生殖細(xì)胞進(jìn)行基目前主要以兩個(gè)途徑利用生殖細(xì)胞進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化：一是利用花粉細(xì)胞和卵細(xì)胞培養(yǎng)，從因轉(zhuǎn)化：一是利用花粉細(xì)胞和卵細(xì)胞培養(yǎng)，從而建立單倍體的基因轉(zhuǎn)化系統(tǒng)；二是直接利用而建立單倍體的基因轉(zhuǎn)化系統(tǒng)；二是直接利用花粉和卵細(xì)胞受精過程進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化花粉和卵細(xì)胞受精過程進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化 優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn): : 一旦將外源基因?qū)脒@些細(xì)胞，一旦將外源基因?qū)脒@些細(xì)胞，可以遺可以遺傳，傳，利用植物自身的受粉過程，具有操作方利用植物自身的受粉過程，具有操作方

25、法方便、簡單。法方便、簡單。缺點(diǎn)缺點(diǎn): : 不足受到季節(jié)的限制；只能花期進(jìn)行，不足受到季節(jié)的限制；只能花期進(jìn)行，且無性繁殖的植物不能采用。且無性繁殖的植物不能采用。 （二）直接轉(zhuǎn)化法（二）直接轉(zhuǎn)化法直接將純化的攜帶有外源基因的直接將純化的攜帶有外源基因的DNADNA導(dǎo)入生物體的方法導(dǎo)入生物體的方法。根據(jù)所采用的原理，可以分為：。根據(jù)所采用的原理，可以分為： 物理轉(zhuǎn)化法、物理轉(zhuǎn)化法、 化學(xué)轉(zhuǎn)化法、化學(xué)轉(zhuǎn)化法、 種質(zhì)介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法。種質(zhì)介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法。 1.1.物理轉(zhuǎn)化法：物理轉(zhuǎn)化法： 通過物理方法打開細(xì)胞屏障通過物理方法打開細(xì)胞屏障( (細(xì)胞壁和細(xì)胞膜細(xì)胞壁和細(xì)胞膜) )，將外源基因直接導(dǎo)入生物體的方法

26、。將外源基因直接導(dǎo)入生物體的方法。 (1)(1)電激法電激法( (電穿孔法電穿孔法) )： (2)(2)超聲法超聲法( (超聲穿孔法超聲穿孔法) )： (3)(3)熱激法：熱激法： (4)(4)顯微注射法：顯微注射法： (5)(5)激光法激光法( (激光穿孔法激光穿孔法) ) (6) (6)基因槍法基因槍法( (微彈法微彈法) ) (1)(1)電激法電激法( (電穿孔法電穿孔法) )： 細(xì)胞膜在適當(dāng)?shù)耐饧与妷鹤饔孟?，?xì)胞膜細(xì)胞膜在適當(dāng)?shù)耐饧与妷鹤饔孟?，?xì)胞膜被擊穿，細(xì)胞周圍的溶液中的外源被擊穿，細(xì)胞周圍的溶液中的外源DNA分子會分子會通過這些孔洞進(jìn)入細(xì)胞中。移去外加電壓后，通過這些孔洞進(jìn)入細(xì)胞

27、中。移去外加電壓后，膜孔在一定時(shí)間內(nèi)可以自動修復(fù)，外源基因進(jìn)膜孔在一定時(shí)間內(nèi)可以自動修復(fù)，外源基因進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)后少數(shù)可能會整合到染色體上。入細(xì)胞內(nèi)后少數(shù)可能會整合到染色體上。 利用這一原理，將原生質(zhì)體與外源基利用這一原理，將原生質(zhì)體與外源基因混合置于電激儀的樣品小室中，然后在因混合置于電激儀的樣品小室中，然后在一定的電壓下進(jìn)行短時(shí)間直流電脈沖，電一定的電壓下進(jìn)行短時(shí)間直流電脈沖，電擊后的原生質(zhì)體被轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)基中培養(yǎng)，擊后的原生質(zhì)體被轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)基中培養(yǎng)，根據(jù)選擇標(biāo)記篩選帶有標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)化子。根據(jù)選擇標(biāo)記篩選帶有標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)化子。 超聲穿孔法超聲穿孔法、熱激法熱激法、顯微注射法顯微注射法、激光法激光

28、法原理與此相同原理與此相同物理轉(zhuǎn)化法步驟：1、目的基因表達(dá)載體DNA溶液配制2、受體細(xì)胞準(zhǔn)備(原生質(zhì)體制備)3、物理法導(dǎo)致細(xì)胞穿孔4、細(xì)胞恢復(fù)培養(yǎng)和篩選基因槍法(微彈法)2.2.化學(xué)轉(zhuǎn)化法化學(xué)轉(zhuǎn)化法(1)(1)聚乙二醇聚乙二醇(PEG)(PEG)法法 PEGPEG與多聚賴氨酸、多聚鳥氨酸等多聚物和與多聚賴氨酸、多聚鳥氨酸等多聚物和二價(jià)陽離子（如二價(jià)陽離子（如MgMg2+2+、CaCa2+2+、MnMn2+2+）及）及DNADNA常在常在原生質(zhì)體表面形成沉淀顆粒，通過原生質(zhì)體的原生質(zhì)體表面形成沉淀顆粒，通過原生質(zhì)體的內(nèi)吸作用而被吸收。內(nèi)吸作用而被吸收。 利用利用PEGPEG誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合時(shí)要求

29、原生質(zhì)誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合時(shí)要求原生質(zhì)體具有較高的活力。體具有較高的活力。(2)(2)脂質(zhì)體法脂質(zhì)體法 帶正電的脂質(zhì)體與核酸帶負(fù)電的磷酸基帶正電的脂質(zhì)體與核酸帶負(fù)電的磷酸基團(tuán)形成復(fù)合物，然后脂質(zhì)體上剩余的電核與團(tuán)形成復(fù)合物，然后脂質(zhì)體上剩余的電核與細(xì)胞膜上的唾液酸殘基的負(fù)電核結(jié)合；另一細(xì)胞膜上的唾液酸殘基的負(fù)電核結(jié)合；另一種解釋是通過內(nèi)吞作用而進(jìn)入細(xì)胞。種解釋是通過內(nèi)吞作用而進(jìn)入細(xì)胞。 3.種質(zhì)介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法種質(zhì)介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法(1)花粉管通道法花粉管通道法 是我國科學(xué)家周光宇等首次提出外源是我國科學(xué)家周光宇等首次提出外源DNA導(dǎo)入植物的轉(zhuǎn)基因技術(shù)。導(dǎo)入植物的轉(zhuǎn)基因技術(shù)。 其基本原理是授粉后使外源其基本原理

30、是授粉后使外源DNA能沿著能沿著花粉管滲入，經(jīng)過珠心通道進(jìn)入胚囊，轉(zhuǎn)化還花粉管滲入，經(jīng)過珠心通道進(jìn)入胚囊，轉(zhuǎn)化還不具備正常細(xì)胞壁的卵、合子或早期胚胎細(xì)胞不具備正常細(xì)胞壁的卵、合子或早期胚胎細(xì)胞 (2)生殖細(xì)胞浸泡法生殖細(xì)胞浸泡法 生殖細(xì)胞生殖細(xì)胞(種子、胚、胚珠、子房、花粉粒、花種子、胚、胚珠、子房、花粉粒、花藥懸浮細(xì)胞培養(yǎng)物等藥懸浮細(xì)胞培養(yǎng)物等)直接浸泡在外源直接浸泡在外源DNA溶液中，溶液中，利用滲透作用把外源基因?qū)胧荏w并整合和遺傳的利用滲透作用把外源基因?qū)胧荏w并整合和遺傳的方法。方法。(3)胚囊、子房注射法胚囊、子房注射法 使用顯微注射儀把外源基因溶液注射到子房或使用顯微注射儀把外源

31、基因溶液注射到子房或胚囊中，由于子房或胚囊中產(chǎn)生的壓力和卵細(xì)胞的胚囊中，由于子房或胚囊中產(chǎn)生的壓力和卵細(xì)胞的吸收使外源吸收使外源DNA進(jìn)入受精的卵細(xì)胞中，從而獲得轉(zhuǎn)進(jìn)入受精的卵細(xì)胞中，從而獲得轉(zhuǎn)基因植株?；蛑仓?。 （三）間接轉(zhuǎn)化法（三）間接轉(zhuǎn)化法(生物轉(zhuǎn)化法生物轉(zhuǎn)化法)1.農(nóng)桿菌介導(dǎo)法農(nóng)桿菌介導(dǎo)法 有兩種農(nóng)桿菌有兩種農(nóng)桿菌:根癌農(nóng)桿菌（根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）發(fā)根農(nóng)桿菌發(fā)根農(nóng)桿菌(A. Rhizogenes) 被廣泛用于植物轉(zhuǎn)基因。被廣泛用于植物轉(zhuǎn)基因。 原理：農(nóng)桿菌在適宜條件下原理：農(nóng)桿菌在適宜條件下(酸性酸性,酚類誘導(dǎo)物如乙酰丁香酚類誘導(dǎo)物如乙酰丁

32、香酮酮)，將其質(zhì)粒，將其質(zhì)粒T-DNA部分可以轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞并插入到植物基部分可以轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞并插入到植物基因組中。因組中。 2.病毒介導(dǎo)法病毒介導(dǎo)法 病毒通過膜糖蛋白和宿主細(xì)胞表面的受體相互作用或病毒通過膜糖蛋白和宿主細(xì)胞表面的受體相互作用或細(xì)胞內(nèi)吞進(jìn)入宿主細(xì)胞，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成細(xì)胞內(nèi)吞進(jìn)入宿主細(xì)胞，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成DNA并隨機(jī)整合到并隨機(jī)整合到宿主基因組中。可介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因的病毒宿主基因組中?？山閷?dǎo)轉(zhuǎn)基因的病毒: (1) (1)雙鏈雙鏈DNADNA病毒病毒 CaMVCaMV花椰菜花葉病毒花椰菜花葉病毒 DaMVDaMV大麗花花葉病毒大麗花花葉病毒 CEKVCEKV石竹飾刻斑紋病毒石竹飾刻斑紋病毒 (2)

33、(2)單鏈單鏈DNADNA病毒病毒 (3)(3)單鏈單鏈RNARNA病毒病毒 癥狀（四）農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法（四）農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法A、整體植株接種共感染法整體植株接種共感染法1 1、原理與方法：、原理與方法：該途徑是模仿自然界農(nóng)桿菌天然的轉(zhuǎn)化過程，人為的在植該途徑是模仿自然界農(nóng)桿菌天然的轉(zhuǎn)化過程，人為的在植株上造成創(chuàng)傷部位，然后把攜帶目的基因表達(dá)載體的農(nóng)桿菌株上造成創(chuàng)傷部位，然后把攜帶目的基因表達(dá)載體的農(nóng)桿菌接種在創(chuàng)傷面上或植株體內(nèi)，使農(nóng)桿菌在植株內(nèi)進(jìn)行侵染轉(zhuǎn)接種在創(chuàng)傷面上或植株體內(nèi)，使農(nóng)桿菌在植株內(nèi)進(jìn)行侵染轉(zhuǎn)化，獲得轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，因此也稱為體內(nèi)轉(zhuǎn)化?；?，獲得轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，因此也稱為體內(nèi)轉(zhuǎn)化。

34、2 2、受體材料：、受體材料：無菌苗、種子實(shí)生苗無菌苗、種子實(shí)生苗3 3、優(yōu)點(diǎn)：試驗(yàn)周期短、具有較高的轉(zhuǎn)化效率、優(yōu)點(diǎn)：試驗(yàn)周期短、具有較高的轉(zhuǎn)化效率、4 4、缺點(diǎn)：嵌合體多、篩選困難、缺點(diǎn)：嵌合體多、篩選困難B、葉盤轉(zhuǎn)化法葉盤轉(zhuǎn)化法 1 1、原理和方法：、原理和方法： 為了誘導(dǎo)農(nóng)桿菌的侵染活性，把無菌苗葉片剪切成圓形為了誘導(dǎo)農(nóng)桿菌的侵染活性，把無菌苗葉片剪切成圓形或方形葉盤，人為地造成較大的傷口或方形葉盤，人為地造成較大的傷口/ /面積比，葉盤浸蘸接種面積比，葉盤浸蘸接種農(nóng)桿菌后，與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)一段時(shí)間后，目的基因可經(jīng)農(nóng)桿農(nóng)桿菌后，與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)一段時(shí)間后，目的基因可經(jīng)農(nóng)桿菌整合到植物染色體上

35、，經(jīng)轉(zhuǎn)接到脫菌培養(yǎng)基上除去農(nóng)桿菌菌整合到植物染色體上，經(jīng)轉(zhuǎn)接到脫菌培養(yǎng)基上除去農(nóng)桿菌，經(jīng)篩選后可得轉(zhuǎn)化植株。，經(jīng)篩選后可得轉(zhuǎn)化植株。 2 2、受體材料：、受體材料： 無菌苗葉片。無菌苗葉片。 3 3、優(yōu)點(diǎn)：、優(yōu)點(diǎn)： 適用性廣、重復(fù)性好適用性廣、重復(fù)性好 缺點(diǎn)：部分材料葉盤再生困難。缺點(diǎn)：部分材料葉盤再生困難。 C、原生質(zhì)體共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化法原生質(zhì)體共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化法1 1、原理同上、原理同上2、受體材料原生質(zhì)體3、優(yōu)點(diǎn)：易轉(zhuǎn)化、無嵌合體4、缺點(diǎn)：再生困難常用植物基因轉(zhuǎn)化方法特點(diǎn)比較評價(jià)條件評價(jià)條件農(nóng)桿菌農(nóng)桿菌PEGPEG法法電擊法電擊法注射注射法法基因槍法基因槍法花粉管通道法花粉管通道法受體材料受體材料組

36、織、組織、原 生 質(zhì)原 生 質(zhì)體體原生質(zhì)原生質(zhì)體體原 生 質(zhì)原 生 質(zhì)體體原生原生質(zhì)體質(zhì)體組織、細(xì)組織、細(xì)胞胞卵細(xì)胞卵細(xì)胞寄主范圍寄主范圍有有無無無無無無無無有性繁殖材料有性繁殖材料組培條件組培條件簡單簡單復(fù)雜復(fù)雜復(fù)雜復(fù)雜復(fù)雜復(fù)雜簡單簡單不需要不需要轉(zhuǎn)化率轉(zhuǎn)化率1-10%1-10%1010-5-4-5-41010-5-4-5-41010-3-2-3-21010-3-2-3-210%1010%10嵌 合 體 比嵌 合 體 比例例有有無無無無無無多多無無操 作 復(fù) 雜操 作 復(fù) 雜性性簡單簡單簡單簡單復(fù)雜復(fù)雜復(fù)雜復(fù)雜復(fù)雜復(fù)雜簡單簡單設(shè)備要求設(shè)備要求簡單簡單簡單簡單昂貴昂貴昂貴昂貴昂貴昂貴簡單簡單工

37、作效率工作效率高高低低低低低低高高低低單 子 葉 植單 子 葉 植物物少少可行可行可行可行可行可行廣泛廣泛廣泛廣泛大麥轉(zhuǎn)化示意圖二二 、轉(zhuǎn)移植株篩選、轉(zhuǎn)移植株篩選1、抗性篩選、抗性篩選2、報(bào)告基因篩選、報(bào)告基因篩選3、DNA檢測檢測4、RNA檢測檢測5、蛋白質(zhì)檢測、蛋白質(zhì)檢測6、功能檢測、功能檢測第五節(jié)第五節(jié) 植物轉(zhuǎn)基因改良的應(yīng)用植物轉(zhuǎn)基因改良的應(yīng)用一、抗蟲改良一、抗蟲改良1、常用常用抗蟲基因抗蟲基因可分為三類可分為三類:(1)細(xì)菌中分離的抗蟲基因細(xì)菌中分離的抗蟲基因,主要是蘇云金桿菌殺蟲結(jié)晶蛋白主要是蘇云金桿菌殺蟲結(jié)晶蛋白(Bt)基因基因;(2)植物中分離的抗蟲基因植物中分離的抗蟲基因,主要

38、為蛋白酶抑制劑基因、淀粉主要為蛋白酶抑制劑基因、淀粉酶抑制劑基因、外源凝集素基因酶抑制劑基因、外源凝集素基因(Lec)等等,應(yīng)用最廣泛的是豇豆應(yīng)用最廣泛的是豇豆胰蛋白酶抑制劑基因胰蛋白酶抑制劑基因(CpTI);(3)從昆蟲從昆蟲中中分離的分離的抗蟲抗蟲基因基因,主要有蝎毒素基因和蜘蛛毒素主要有蝎毒素基因和蜘蛛毒素基因等?；虻?。2 2、殺蟲原理、殺蟲原理(1)BT(1)BT基因基因 BtBt基因又稱殺蟲結(jié)晶蛋白基因又稱殺蟲結(jié)晶蛋白(insecticidal crystal (insecticidal crystal protein. ICP)protein. ICP)基因基因, , 來自于蘇云

39、金芽孢桿菌來自于蘇云金芽孢桿菌, ,其殺蟲毒性來自其殺蟲毒性來自芽孢形成過程中產(chǎn)生的殺蟲晶體蛋白芽孢形成過程中產(chǎn)生的殺蟲晶體蛋白( (或或內(nèi)毒素內(nèi)毒素) )。 原理原理: :破壞昆蟲的消化系統(tǒng)破壞昆蟲的消化系統(tǒng). .這種蛋白通常以原毒素形式這種蛋白通常以原毒素形式存在存在, ,當(dāng)昆蟲取食后當(dāng)昆蟲取食后, ,原毒素在消化道內(nèi)被活化，破壞腸道細(xì)胞原毒素在消化道內(nèi)被活化，破壞腸道細(xì)胞膜上的特異性結(jié)合蛋白膜上的特異性結(jié)合蛋白, , 使細(xì)胞膜產(chǎn)生一些孔道。使細(xì)胞膜產(chǎn)生一些孔道。 目前常見的目前常見的btbt基因分為基因分為7 7類，共類，共3030多個(gè)小多個(gè)小類，分別可以抗鱗翅目、膜翅目、雙翅目、類，分

40、別可以抗鱗翅目、膜翅目、雙翅目、鞘翅目害蟲以及線蟲，有些種類具有多種昆鞘翅目害蟲以及線蟲，有些種類具有多種昆蟲抗性。蟲抗性。 抗蟲棉基因的轉(zhuǎn)化過程70由中國農(nóng)科院生物工程中心開發(fā)的Bt棉對棉鈴蟲有顯著的抗性。與對照相比減少農(nóng)藥用量80，并減少用工150個(gè)/hm2，以上兩者可使每公頃節(jié)省1500元，Bt轉(zhuǎn)基因棉種深受棉農(nóng)的歡迎。(2)胰蛋白酶抑制劑基因胰蛋白酶抑制劑基因 植物中存在三類蛋白酶抑制劑：植物中存在三類蛋白酶抑制劑： 絲氨酸蛋白酶抑制劑絲氨酸蛋白酶抑制劑 巰基蛋白酶抑制劑巰基蛋白酶抑制劑 金屬蛋白酶抑制劑。金屬蛋白酶抑制劑。 其中絲氨酸蛋白酶抑制劑中的豇豆胰蛋白酶抑其中絲氨酸蛋白酶抑制

41、劑中的豇豆胰蛋白酶抑制劑基因制劑基因(CpTI)是目前研究得較為深入且應(yīng)用最為是目前研究得較為深入且應(yīng)用最為廣泛的基因。廣泛的基因。 蛋白酶抑制劑殺蟲機(jī)理蛋白酶抑制劑殺蟲機(jī)理: : 蛋白酶抑制劑與昆蟲消化道的蛋白酶相結(jié)合蛋白酶抑制劑與昆蟲消化道的蛋白酶相結(jié)合, ,形形成酶成酶- -抑制劑復(fù)合物抑制劑復(fù)合物, ,使酶活性中心失活使酶活性中心失活, ,從而阻斷或從而阻斷或減弱酶的水解作用減弱酶的水解作用, ,干擾昆蟲對外來蛋白的正常消化干擾昆蟲對外來蛋白的正常消化, , 最終造成昆蟲非正常發(fā)育或死亡。最終造成昆蟲非正常發(fā)育或死亡。 (3)植物凝集素基因植物凝集素基因(Lec) 植物凝集素是植物體普

42、遍存在的一類保守性很植物凝集素是植物體普遍存在的一類保守性很強(qiáng)的非免疫性蛋白強(qiáng)的非免疫性蛋白,能特異性識別并可逆地結(jié)合糖能特異性識別并可逆地結(jié)合糖蛋蛋白白的糖基部分。的糖基部分。 麥胚凝集素麥胚凝集素(WGA),對歐洲玉米螟有良好的抗性。對歐洲玉米螟有良好的抗性。雪蓮花凝集素雪蓮花凝集素(GNA)對蚜蟲、葉蟬、稻飛虱等同對蚜蟲、葉蟬、稻飛虱等同翅目吸食性害蟲有極強(qiáng)的毒性。翅目吸食性害蟲有極強(qiáng)的毒性。豌豆外凝集素豌豆外凝集素(p-Lec)能抑制豇豆象的生長。能抑制豇豆象的生長。 作用機(jī)理作用機(jī)理: : 當(dāng)昆蟲取食外凝集素后當(dāng)昆蟲取食外凝集素后, ,外源凝集素在昆蟲消外源凝集素在昆蟲消化道周圍的細(xì)

43、胞膜糖蛋白專一性結(jié)合化道周圍的細(xì)胞膜糖蛋白專一性結(jié)合, ,從而影響所有從而影響所有營養(yǎng)的吸收營養(yǎng)的吸收, ,達(dá)到抗蟲目的。達(dá)到抗蟲目的。(4)(4)淀粉酶抑制劑淀粉酶抑制劑 淀粉酶抑制劑能抑制昆蟲消化道內(nèi)淀粉酶抑制劑能抑制昆蟲消化道內(nèi)-淀粉酶淀粉酶活性活性, ,使食入的淀粉無法水解使食入的淀粉無法水解, ,阻斷了昆蟲主要能量阻斷了昆蟲主要能量來源；來源； 它與淀粉酶形成的酶它與淀粉酶形成的酶- -抑制劑復(fù)合物通過生理反抑制劑復(fù)合物通過生理反饋調(diào)節(jié)作用饋調(diào)節(jié)作用, ,刺激昆蟲分泌過量的消化酶刺激昆蟲分泌過量的消化酶, ,產(chǎn)生厭食產(chǎn)生厭食反應(yīng)。反應(yīng)。 (5)(5)昆蟲毒素基因昆蟲毒素基因 昆蟲神經(jīng)

44、毒素控制著昆蟲許多關(guān)鍵的生理過程昆蟲神經(jīng)毒素控制著昆蟲許多關(guān)鍵的生理過程, ,影響昆蟲的生長、變態(tài)、生殖、代謝和行為等影響昆蟲的生長、變態(tài)、生殖、代謝和行為等, ,近年近年來來, ,人們已開始在基因工程中利用昆蟲神經(jīng)毒素防治人們已開始在基因工程中利用昆蟲神經(jīng)毒素防治害蟲。害蟲。 目前目前, ,蝎毒素和蜘蛛毒素兩種昆蟲特異性神經(jīng)毒蝎毒素和蜘蛛毒素兩種昆蟲特異性神經(jīng)毒素已被用于植物抗蟲基因工程。素已被用于植物抗蟲基因工程。 由于每一種抗蟲基因都有其局限性由于每一種抗蟲基因都有其局限性,近年近年來正在研究或已應(yīng)用于抗蟲基因工程的基因來正在研究或已應(yīng)用于抗蟲基因工程的基因還有膽固醇氧化酶基因、營養(yǎng)殺蟲

45、蛋白基因、還有膽固醇氧化酶基因、營養(yǎng)殺蟲蛋白基因、幾丁質(zhì)酶基因、核糖體失活蛋白基因和異戊幾丁質(zhì)酶基因、核糖體失活蛋白基因和異戊烯轉(zhuǎn)移酶基因等。烯轉(zhuǎn)移酶基因等。 ( (二二) )抗真菌病改良抗真菌病改良1、抗真菌病基因、抗真菌病基因根據(jù)植物的防衛(wèi)機(jī)制和病原菌致病機(jī)理，已知的根據(jù)植物的防衛(wèi)機(jī)制和病原菌致病機(jī)理，已知的植物抗真菌病基因主要有以下兩個(gè)方面：植物抗真菌病基因主要有以下兩個(gè)方面： 一是細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)增強(qiáng)基因，一是細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)增強(qiáng)基因， 二是生成抗菌物質(zhì)或激活抗菌物質(zhì)活性的基因二是生成抗菌物質(zhì)或激活抗菌物質(zhì)活性的基因 第一類基因目前應(yīng)用較少，第二類基因已經(jīng)開第一類基因目前應(yīng)用較少，第二類基因已經(jīng)開

46、始大量應(yīng)用。始大量應(yīng)用。 2 2、主要抗真菌病基因及作用機(jī)理、主要抗真菌病基因及作用機(jī)理(1)(1)幾丁質(zhì)酶基因幾丁質(zhì)酶基因 植物和微生物中幾丁質(zhì)酶基因編碼的降解幾丁植物和微生物中幾丁質(zhì)酶基因編碼的降解幾丁質(zhì)酶。幾丁質(zhì)是植物病原真菌的細(xì)胞壁主要成分之質(zhì)酶。幾丁質(zhì)是植物病原真菌的細(xì)胞壁主要成分之一，幾丁質(zhì)的降解可以導(dǎo)致病原細(xì)胞死亡，也可以一，幾丁質(zhì)的降解可以導(dǎo)致病原細(xì)胞死亡，也可以誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病反應(yīng)。誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病反應(yīng)。(2)-1(2)-1，3-3-葡聚糖酶基因葡聚糖酶基因 -1-1，3-3-葡聚糖是植物病原真菌的細(xì)胞壁主要成葡聚糖是植物病原真菌的細(xì)胞壁主要成分之一，的降解可以導(dǎo)致病原細(xì)胞死

47、亡，也可以誘分之一，的降解可以導(dǎo)致病原細(xì)胞死亡，也可以誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病反應(yīng)。導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病反應(yīng)。 (3)(3)植物抗毒素基因植物抗毒素基因 植物產(chǎn)生的對病原真菌具有毒性的物質(zhì)，稱為植物產(chǎn)生的對病原真菌具有毒性的物質(zhì)，稱為植物抗毒素，編碼此類物質(zhì)合成酶的基因稱為植物植物抗毒素，編碼此類物質(zhì)合成酶的基因稱為植物抗毒素基因?？苟舅鼗?。 目前已從不同科屬植物中鑒定了目前已從不同科屬植物中鑒定了200200多種，其中多種，其中以類黃酮和萜烯類最多。其中的關(guān)鍵酶如苯丙氨酸以類黃酮和萜烯類最多。其中的關(guān)鍵酶如苯丙氨酸裂解酶基因裂解酶基因(PAL)(PAL)已經(jīng)克隆。其中芪合成酶基因已從已經(jīng)克隆。其中芪合成

48、酶基因已從葡萄、花生等植物中克隆并轉(zhuǎn)入煙草中獲得了抗病葡萄、花生等植物中克隆并轉(zhuǎn)入煙草中獲得了抗病性植株。性植株。 (4)核糖體抑制蛋白基因核糖體抑制蛋白基因(Ribosome inhibiting protein, RIP) 核糖體抑制蛋白是來源于植物能作用于其他遠(yuǎn)緣核糖體抑制蛋白是來源于植物能作用于其他遠(yuǎn)緣真核生物核糖體、抑制蛋白質(zhì)合成的蛋白毒素?，F(xiàn)已真核生物核糖體、抑制蛋白質(zhì)合成的蛋白毒素?，F(xiàn)已經(jīng)從大麥中分離了經(jīng)從大麥中分離了RIP并在體外抑制了真菌的活性。并在體外抑制了真菌的活性。(5)過氧化物酶基因過氧化物酶基因 參與苯丙烷代謝，形成木質(zhì)素、植保素及細(xì)胞壁參與苯丙烷代謝，形成木質(zhì)素、

49、植保素及細(xì)胞壁酚類物質(zhì)。酚類物質(zhì)。 ( (三三) )抗細(xì)菌性病害改良抗細(xì)菌性病害改良1 1、抗菌肽基因、抗菌肽基因 抗菌肽是一類從動物、植物中分離得到的具有抗菌活性并抗菌肽是一類從動物、植物中分離得到的具有抗菌活性并且同源性較高的小分子多肽?？咕挠汕彝葱暂^高的小分子多肽?？咕挠?030多個(gè)氨基酸擦殘基多個(gè)氨基酸擦殘基組成，分子量大約為組成，分子量大約為4kd4kd，殺菌肽具有雙親性的，殺菌肽具有雙親性的螺旋結(jié)構(gòu)，螺旋結(jié)構(gòu)，是殺菌肽破壞膜活性的關(guān)鍵。殺菌肽具有光譜抗菌性，主要分是殺菌肽破壞膜活性的關(guān)鍵。殺菌肽具有光譜抗菌性，主要分為為A A、B B、D D三種形式，其中三種形式，其中A A

50、、B B特別對革蘭氏陰性菌有強(qiáng)大特別對革蘭氏陰性菌有強(qiáng)大的殺傷力的殺傷力2 2、溶菌酶基因、溶菌酶基因 溶菌酶能夠溶解細(xì)菌細(xì)胞外一些多糖之間的糖苷鍵，導(dǎo)致溶菌酶能夠溶解細(xì)菌細(xì)胞外一些多糖之間的糖苷鍵，導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞缺乏支撐最后漲破。細(xì)菌細(xì)胞缺乏支撐最后漲破。 3 3、病原菌本身抗性基因、病原菌本身抗性基因 病原菌本身參與寄主識別的基因在寄主相互病原菌本身參與寄主識別的基因在寄主相互作用時(shí)其重要，將病原菌的這些基因轉(zhuǎn)入植物中，作用時(shí)其重要，將病原菌的這些基因轉(zhuǎn)入植物中，使其表達(dá)，從而干擾病原菌的正常生理代謝，導(dǎo)致使其表達(dá)，從而干擾病原菌的正常生理代謝，導(dǎo)致植物表現(xiàn)出抗性。植物表現(xiàn)出抗性。(四四)抗

51、病毒改良抗病毒改良 1 1、CPCP基因基因 病毒外殼蛋白病毒外殼蛋白(coat protein,CP)(coat protein,CP)基因是病毒編碼外殼蛋白基因是病毒編碼外殼蛋白的基因，利用病毒外殼蛋白轉(zhuǎn)基因增強(qiáng)植物抗病毒能力的原的基因，利用病毒外殼蛋白轉(zhuǎn)基因增強(qiáng)植物抗病毒能力的原理是：理是： 病毒的裸露的核酸進(jìn)入植物細(xì)胞后，立即被植物細(xì)胞中病毒的裸露的核酸進(jìn)入植物細(xì)胞后，立即被植物細(xì)胞中的的CPCP包裹，阻止了翻譯和復(fù)制。包裹，阻止了翻譯和復(fù)制。 CPCP抑制病毒脫殼。抑制病毒脫殼。 侵染信號識別，如發(fā)現(xiàn)侵染信號識別，如發(fā)現(xiàn)CPCP則不侵染，未發(fā)現(xiàn)則侵染。則不侵染，未發(fā)現(xiàn)則侵染。 2 2

52、、病毒復(fù)制酶基因、病毒復(fù)制酶基因 病毒復(fù)制酶基因在病毒侵入植物后與植物核糖病毒復(fù)制酶基因在病毒侵入植物后與植物核糖體結(jié)合后轉(zhuǎn)錄并表達(dá)成病毒復(fù)制酶。體結(jié)合后轉(zhuǎn)錄并表達(dá)成病毒復(fù)制酶。該基因?qū)胫参锖?，可誘導(dǎo)植物產(chǎn)生病毒抗性。該基因?qū)胫参锖?，可誘導(dǎo)植物產(chǎn)生病毒抗性。作用原理不明。作用原理不明。 病毒復(fù)制酶介導(dǎo)的抗性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于外殼蛋白基因病毒復(fù)制酶介導(dǎo)的抗性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于外殼蛋白基因介導(dǎo)的的抗性，即使病毒接種量很高，仍然存在抗性介導(dǎo)的的抗性，即使病毒接種量很高，仍然存在抗性。 3 3、病毒衛(wèi)星、病毒衛(wèi)星RNA RNA 病毒中在核苷酸序列外有時(shí)會出現(xiàn)病毒衛(wèi)星病毒中在核苷酸序列外有時(shí)會出現(xiàn)病毒衛(wèi)星RNARNA，

53、他們不與核苷酸序列同源，但可以改變病毒，他們不與核苷酸序列同源，但可以改變病毒的致病能力。的致病能力。 優(yōu)點(diǎn)：靈敏，優(yōu)點(diǎn)：靈敏， 缺點(diǎn)：不確定性，增強(qiáng)或減弱致病性，來源有限缺點(diǎn)：不確定性，增強(qiáng)或減弱致病性，來源有限，重組風(fēng)險(xiǎn)、釋放風(fēng)險(xiǎn)，重組風(fēng)險(xiǎn)、釋放風(fēng)險(xiǎn) 4 4、核糖體抑制蛋白基因、核糖體抑制蛋白基因 核糖體失活蛋白核糖體失活蛋白(ribosome inactive protein, (ribosome inactive protein, RIP) RIP) 可以抑制病毒蛋白質(zhì)生物合成，使病毒不能合可以抑制病毒蛋白質(zhì)生物合成，使病毒不能合成自身蛋白質(zhì)。核糖體失活蛋白基因可以使植物獲成自身蛋白質(zhì)

54、。核糖體失活蛋白基因可以使植物獲得廣譜性病毒抗性。得廣譜性病毒抗性。5 5、干擾素基因、干擾素基因干擾素是脊椎動物在受病毒侵染后形成的一種干擾素是脊椎動物在受病毒侵染后形成的一種小分子蛋白質(zhì)，能結(jié)合在細(xì)胞膜上形成抗病毒狀態(tài)小分子蛋白質(zhì)，能結(jié)合在細(xì)胞膜上形成抗病毒狀態(tài)。原理是干擾素可以抑制病毒與細(xì)胞膜的結(jié)合。原理是干擾素可以抑制病毒與細(xì)胞膜的結(jié)合。 6 6、缺陷干擾顆粒、缺陷干擾顆粒 缺陷干擾顆粒缺陷干擾顆粒(defective interfering, DI)(defective interfering, DI)是指那是指那些序列與親本病毒相似但必須依賴親本病毒才能復(fù)制些序列與親本病毒相似但必

55、須依賴親本病毒才能復(fù)制的的RNARNA分子。它的序列與病毒同源。分子。它的序列與病毒同源。 抗病毒原理：競爭病毒復(fù)制酶?？共《驹恚焊偁幉《緩?fù)制酶。 (五五)抗除草劑改良抗除草劑改良1 1、各類除草劑的作用機(jī)理、各類除草劑的作用機(jī)理( (作用的靶酶作用的靶酶) )(1)(1)草甘膦草甘膦(glyphosate)(glyphosate)抑制芳香族氨基酸合成的關(guān)鍵酶：莽抑制芳香族氨基酸合成的關(guān)鍵酶：莽草酸羥基乙烯轉(zhuǎn)移酶草酸羥基乙烯轉(zhuǎn)移酶(EPSPS)(EPSPS)活性?；钚?。(2)(2)磺酰脲磺酰脲(sulfonylurea)(sulfonylurea)抑制支鏈氨基酸合成的關(guān)鍵酶：乙抑制支鏈氨基酸

56、合成的關(guān)鍵酶：乙酰乳酸合成酶酰乳酸合成酶(acetolactate synthase, ALS)(acetolactate synthase, ALS)活性。活性。(3)(3)草丁膦草丁膦(phosphinothricin)(phosphinothricin)是有機(jī)磷除草劑，抑制植物谷是有機(jī)磷除草劑，抑制植物谷胱甘肽合成酶胱甘肽合成酶(Glutamine synthase(Glutamine synthase，GS)GS)(4)(4)三嗪除草劑三嗪除草劑(triazine)(triazine)抑制光合系統(tǒng)抑制光合系統(tǒng)II II的的QbQb蛋白與質(zhì)體醌蛋白與質(zhì)體醌的結(jié)合，阻斷光合作用。的結(jié)合，阻

57、斷光合作用。(5)(5)溴苯腈溴苯腈(bromoxyril)(bromoxyril)抑制光合作用系統(tǒng)的電子傳遞鏈。抑制光合作用系統(tǒng)的電子傳遞鏈。 2 2、抗除草劑轉(zhuǎn)基因改良策略、抗除草劑轉(zhuǎn)基因改良策略(1)(1)靶蛋白過量產(chǎn)生：靶蛋白過量產(chǎn)生：機(jī)理：產(chǎn)生過量靶蛋白，使抑制作用有限。機(jī)理：產(chǎn)生過量靶蛋白，使抑制作用有限。舉例：采用超量表達(dá)載體轉(zhuǎn)基因表達(dá)舉例：采用超量表達(dá)載體轉(zhuǎn)基因表達(dá)EPSPSEPSPS，可以抗草甘磷類除草劑，可以抗草甘磷類除草劑(2)(2)靶蛋白基因突變：靶蛋白基因突變：機(jī)理：尋找對除草劑不敏感的植株并克隆其中的靶蛋白編碼基因。機(jī)理：尋找對除草劑不敏感的植株并克隆其中的靶蛋白編

58、碼基因。但往往導(dǎo)致植物減產(chǎn)。但往往導(dǎo)致植物減產(chǎn)。舉例：除草劑選擇法，尋找靶酶舉例：除草劑選擇法，尋找靶酶EPSPS/ALS/QbEPSPS/ALS/Qb的突變體，進(jìn)行繁殖的突變體，進(jìn)行繁殖，或者克隆其中的基因進(jìn)行轉(zhuǎn)基因育種。，或者克隆其中的基因進(jìn)行轉(zhuǎn)基因育種。 (3)(3)除草劑降解和解毒基因利用：除草劑降解和解毒基因利用： 乙酰輔酶乙酰輔酶A A轉(zhuǎn)移酶基因轉(zhuǎn)移酶基因- -草丁膦，草丁膦，bar:bar:來源于來源于鏈霉素的乙酰輔酶鏈霉素的乙酰輔酶A A轉(zhuǎn)移酶基因轉(zhuǎn)移酶基因水解酶基因及其利用：腈水解酶水解酶基因及其利用：腈水解酶(nitrilase)(nitrilase)超氧化物岐化酶：超氧化

59、物岐化酶：SOD SOD (六六)抗寒性改良抗寒性改良1 1、抗凍蛋白基因、抗凍蛋白基因(1)(1)來源：生物中具有降低冰點(diǎn)和減少冰晶生長速來源：生物中具有降低冰點(diǎn)和減少冰晶生長速度的蛋白質(zhì)。其中魚類研究較多。度的蛋白質(zhì)。其中魚類研究較多。(2)(2)抗凍機(jī)制：抗凍蛋白可以和冰核結(jié)合，減少冰抗凍機(jī)制：抗凍蛋白可以和冰核結(jié)合，減少冰晶生長，降低溶液冰點(diǎn)，從而抑制結(jié)冰傷害。晶生長，降低溶液冰點(diǎn)，從而抑制結(jié)冰傷害。2 2、滲透調(diào)節(jié)相關(guān)基因、滲透調(diào)節(jié)相關(guān)基因 93轉(zhuǎn)轉(zhuǎn) 基基 因因 甜甜 椒椒轉(zhuǎn)基因辣椒可在冬季生長(以色列) (七七)抗旱、抗?jié)掣牧伎购怠⒖節(jié)掣牧? 1、脯氨酸合成酶基因、脯氨酸合成酶基因

60、 (1)(1)大豆大豆(P5CR)(P5CR)、黑麥、黑麥 (2)(2)作用機(jī)理：滲透調(diào)節(jié)作用機(jī)理：滲透調(diào)節(jié)2 2、甜菜堿合成相關(guān)酶基因、甜菜堿合成相關(guān)酶基因 (1)(1)相關(guān)酶：膽堿加單氧酶相關(guān)酶：膽堿加單氧酶(CMO)(CMO)、甜菜堿醛脫氫酶、甜菜堿醛脫氫酶(BADH)(BADH) (2) (2)作用機(jī)理：滲透調(diào)節(jié)作用機(jī)理：滲透調(diào)節(jié) 3 3、滲調(diào)蛋白基因、滲調(diào)蛋白基因(1)(1)滲調(diào)蛋白滲調(diào)蛋白(osmotin(osmotin，OSM)OSM)，植物中普遍存在，植物中普遍存在(2)(2)作用機(jī)理：滲透調(diào)節(jié)作用機(jī)理：滲透調(diào)節(jié)4 4、胚胎后期豐富蛋白、胚胎后期豐富蛋白(lateral emb