1、遺傳性疾病的概述和分子診斷 遺傳性疾病的概述和分子診斷概 述 遺傳性疾病 是由遺傳物質(zhì)改變所導致的疾病或缺陷，按一定的方式垂直傳遞。 我國每年新出生人口中6患有不同的遺傳病，新增遺傳病患兒約120萬 遺傳病的發(fā)病率逐漸升高遺傳性疾病的概述和分子診斷遺傳病的分類基因病 染色體病體細胞遺傳病單基因遺傳病 多基因遺傳病遺傳性疾病的概述和分子診斷一、單基因遺傳病的分子診斷遺傳性疾病的概述和分子診斷定 義單基因遺傳病 (monogenic disease) 指單個基因突變所引起的遺傳病。 特點：病種較多，單個疾病發(fā)病率低臨床表現(xiàn)復雜多樣遺傳規(guī)律符合孟德爾定律遺傳性疾病的概述和分子診斷1.單基因遺傳病發(fā)病

2、的分子機制單基因遺傳病的基因突變類型 基因的外顯子或內(nèi)含子完全或部分缺失 基因的單堿基突變 三核苷酸重復突變 基因部分片段重復轉(zhuǎn)錄，基因產(chǎn)物大小改變 插入突變，基因組其他部位的DNA片段插入到目的DNA序列內(nèi)遺傳性疾病的概述和分子診斷2.單基因遺傳病的分類 常染色體顯性遺傳 常染色體隱性遺傳 X連鎖顯性遺傳 X連鎖隱性遺傳 Y連鎖遺傳遺傳性疾病的概述和分子診斷(1) 常染色體顯性遺傳 (autosomal dominant inheritance, AD)致病基因位于常染色體一對等位基因中只要有一個致病基因就可表現(xiàn)出基本性狀男女患病機會相等如：先天性軟骨發(fā)育不全病、亨廷頓病遺傳性疾病的概述和分

3、子診斷(2) 常染色體隱性遺傳 (autosomal recessive inheritance, AR)致病基因位于常染色體攜帶一個隱性致病基因的雜合子不表現(xiàn)癥狀，只有獲得一對隱性基因的純合子才表現(xiàn)出相應癥狀男女受累機會均等如：苯丙酮尿癥、白化病遺傳性疾病的概述和分子診斷(3) X連鎖顯性遺傳 (X-linked dominant inheritance, XD)致病基因位于X染色體以顯性遺傳的方式向后代遺傳男性患者的女兒全部為患者，兒子全部正常，女性患者的子女中各有50可能性是患者如：葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥、假性甲狀腺功能減退病遺傳性疾病的概述和分子診斷(4) X連鎖隱性遺傳 (X-

4、linked recessive inheritance, XR)致病基因位于X染色體女性在純合子時表現(xiàn)出相應性狀；攜帶一個隱性致病基因時，為表型正常的致病基因攜帶者男性X染色體上有一個隱性致病基因就會發(fā)病如：甲型血友病、紅綠色盲遺傳性疾病的概述和分子診斷(5) Y連鎖遺傳 (Y-linked inheritance, YL)致病基因位于Y染色體伴隨Y染色體以顯性遺傳方式向男性后代傳遞只有男性才表現(xiàn)出相應性狀如：外耳道多毛癥遺傳性疾病的概述和分子診斷遺傳性疾病的概述和分子診斷3.單基因遺傳病的基因診斷表型診斷 根據(jù)癥狀體征來判斷病因并診斷分子診斷（基因診斷） 直接檢測患者基因(DNA)或其轉(zhuǎn)錄

5、產(chǎn)物(mRNA)診斷疾病 基因診斷是當前診斷遺傳病最精確的方法遺傳性疾病的概述和分子診斷(1) 基因診斷的思路從蛋白質(zhì)入手從蛋白質(zhì)到核酸，由表型至基因型從DNA入手由DNA到蛋白質(zhì)從候選基因入手遺傳性疾病的概述和分子診斷從蛋白質(zhì)入手明確蛋白產(chǎn)物測定蛋白質(zhì)的氨基酸序列合成DNA探針篩選編碼基因或cDNA克隆DNA測序確定導致疾病的分子缺陷遺傳性疾病的概述和分子診斷從蛋白質(zhì)入手通過該策略診斷許多單基因遺傳疾病白化病苯丙酮尿癥鐮狀細胞貧血該策略已較少采用遺傳性疾病的概述和分子診斷 從DNA入手連鎖分析確定致病基因的染色體定位在該區(qū)域內(nèi)搜索、分離致病基因找到導致遺傳病的分子缺陷闡明正常與異?；虍a(chǎn)物的

6、生理功能和病理效應遺傳性疾病的概述和分子診斷從DNA入手當前遺傳性疾病診斷的主要策略杜氏肌營養(yǎng)不良亨廷頓舞蹈病該策略的關(guān)鍵是DNA標志物遺傳性疾病的概述和分子診斷從候選基因入手將某一疾病基因初步定位以該區(qū)域中已克隆的無名基因、cDNA等為候選者根據(jù)定位結(jié)構(gòu)是否相同來鑒定疾病相關(guān)基因此方法具有速度快、效率高的優(yōu)點遺傳性疾病的概述和分子診斷(2)基因診斷的途徑確定單基因遺傳疾病后，再確定基因檢測的方法采集先證者及其父母的DNA；攜帶者基因分析時，需采集與患者、攜帶者有血緣關(guān)系的親屬樣品從人體組織的有核細胞中提取分離DNA外周血有核細胞、口腔黏膜、毛囊細胞遺傳性疾病的概述和分子診斷(2)基因診斷的途

7、徑DNA印跡法(Southern blotting) 分析基因或基因片段的缺失、插入或動態(tài)突變PCR及其衍生技術(shù) 分析核苷酸取代、缺失或插入造成的點突變基因芯片技術(shù) 自動化、微量化、高通量遺傳性疾病的概述和分子診斷4.單基因遺傳病基因診斷中存在的問題(1) 遺傳異質(zhì)性(genetic heterogeneity) 由同一或不同基因座的不同突變所致的非常類似的表型 同一種表型可由多個不同的基因型控制 大多數(shù)遺傳病都有遺傳異質(zhì)性遺傳性疾病的概述和分子診斷 遺傳異質(zhì)性1) 等位基因異質(zhì)性 由同一基因座不同突變所致非常類似的表型地中海貧血可由100多種突變引起2) 基因座異質(zhì)性 由不同基因座不同突變所

8、致非常類似的表型遺傳性疾病的概述和分子診斷4.單基因遺傳病基因診斷中存在的問題(2) 基因突變的多樣性基因突變包括缺失、插入、替換和動態(tài)突變等(3) 臨床診斷是基因診斷的基礎(chǔ) 基因診斷前注意臨床診斷的準確性多數(shù)遺傳病需依靠多態(tài)性標志物進行家系連鎖分析，確定疾病相關(guān)基因遺傳性疾病的概述和分子診斷4.單基因遺傳病基因診斷中存在的問題(4)基因診斷方法的選擇根據(jù)基因診斷的目的慎重選擇方法產(chǎn)前診斷時，應選擇高特異性和高靈敏度的方法，可同時應用兩種以上原理不同的方法進行檢測，減低誤診率遺傳性疾病的概述和分子診斷(二)常染色體顯性遺傳病的分子診斷亨廷頓病 (Huntington disease, HD)常

9、染色體顯性遺傳病常于3045歲緩慢起病，臨床表現(xiàn)為進行性加重的舞蹈樣不自主運動和智能障患者大多有家族史，患病率為5/10萬10/10萬遺傳性疾病的概述和分子診斷1.HD基因的結(jié)構(gòu)與定位 亨廷頓病相關(guān)基因ITl5 (interesting transcript 15)位于染色體4p16.3，由67個外顯子構(gòu)成，編碼產(chǎn)生蛋白質(zhì)huntingtinIT15基因外顯子1的起始密碼子ATG下游17個密碼子處有一段多態(tài)性的CAG重復序列，轉(zhuǎn)錄翻譯產(chǎn)生一段聚谷氨酰胺連于huntingtin蛋白的N端遺傳性疾病的概述和分子診斷2. ITl5基因在HD中的變化正常IT15基因的(CAG)n重復長度為934個重復

10、單位HD患者n36，最多超過120疾病狀態(tài)下，IT15基因(CAG)n重復的多少與發(fā)病的早晚、疾病的嚴重程度呈正比遺傳性疾病的概述和分子診斷遺傳性疾病的概述和分子診斷3.亨廷頓病的基因診斷方法基因診斷主要檢測(CAG)n重復次數(shù)普通PCR：檢測出重復次數(shù)較少的小片段Southern印跡法：分析重復次數(shù)很大的樣本遺傳性疾病的概述和分子診斷遺傳性疾病的概述和分子診斷(三)常染色體顯性遺傳病的分子診斷鐮狀細胞貧血 (sickle cell anemia, SCA)遺傳性疾病的概述和分子診斷(三)常染色體顯性遺傳病的分子診斷鐮狀細胞貧血 (sickle cell anemia, SCA)常染色體隱性遺

11、傳病血紅蛋白基因突變導致鐮狀血紅蛋白(HbS)取代正常血紅蛋白(HbA)熱帶非洲黑人發(fā)病率高達40遺傳性疾病的概述和分子診斷 1.鐮狀細胞貧血的遺傳學發(fā)病機制珠蛋白基因第6位密碼子GAG變?yōu)镚TA，HbA的鏈第6位谷氨酸被纈氨酸取代，形成HbS缺氧時，HbS溶解度降低，在細胞內(nèi)聚合，紅細胞變形扭曲成鐮刀狀遺傳性疾病的概述和分子診斷2 鐮狀細胞貧血的基因分型 純合子(SS)型 沒有正常的血紅蛋白，病情嚴重雜合子(AS)型 鐮狀細胞基因攜帶者，一般無異常表現(xiàn)，僅在低氧情況下出現(xiàn)鐮狀紅細胞雙重雜合子型 臨床癥狀輕微遺傳性疾病的概述和分子診斷3. 鐮狀細胞貧血的基因診斷方法限制性內(nèi)切酶分析法限制性內(nèi)切

12、酶MstDNA印跡法等位基因-RFLP連鎖分析遺傳性疾病的概述和分子診斷限制性內(nèi)切酶分析法利用內(nèi)切酶Mst消化待檢的DNA樣品正常的A和突變的S第5-7位密碼子序列： 正常A ：CCTGAGGAG 突變S ：CCTGTGGAG 第6位密碼A變成T，使Mst II不能識別遺傳性疾病的概述和分子診斷(四)X連鎖顯性遺傳病的分子診斷脆性X綜合征 (fragile X syndrome, FraX)X連鎖顯性遺傳病最常見的遺傳性智力障礙男性群體中的發(fā)生率為1/20001/1000，男、女患病的比率為2:1遺傳性疾病的概述和分子診斷脆性X綜合征 遺傳性疾病的概述和分子診斷1. 脆性X智力障礙基因的結(jié)構(gòu)與

13、定位脆性X基因(FMR-1)缺陷使FMR-1蛋白(FMRP)生成減少或缺乏，導致脆性X綜合征FMR-1基因位于Xq27.3，在基因組中跨越38 kb，由17個外顯子和16個內(nèi)含子組成遺傳性疾病的概述和分子診斷2. 脆性X智力障礙基因的突變特征 FMR-l基因5端外顯子上的非翻譯區(qū)有一(CGG)n重復序列的多態(tài)性結(jié)構(gòu)，正常人群 (CGG)n重復次數(shù)在650之間1)FMR-1基因(CGG)n重復序列異常擴增前突變：(CGG)n重復數(shù)為50200全突變：(CGG)n重復數(shù)200遺傳性疾病的概述和分子診斷2. 脆性X智力障礙基因的突變特征(2) FMR-1基因5端CpG島的異常甲基化 FMR-1轉(zhuǎn)錄受

14、抑制或減弱，F(xiàn)MRP表達受阻(3) FMR-1基因的缺失和點突變 FMR-1基因的錯義突變和缺失型突變影響 FMRP的正常結(jié)構(gòu)遺傳性疾病的概述和分子診斷3. 脆性X綜合征的基因診斷方法1) Southern blot分析檢測(CGG)n的拷貝數(shù)和甲基化狀態(tài)確認全突變與前突變適用于患者及攜帶者的診斷2) PCR方法擴增(CGG)n重復序列，檢測擴增片段長度嵌合體患者有較小的(CGG)n片段，也有PCR擴增產(chǎn)物，可導致假陽性遺傳性疾病的概述和分子診斷(五)X連鎖隱性遺傳病的分子診斷Duchenne肌營養(yǎng)不良(DMD)和Becker肌營養(yǎng)不良(BMD)X連鎖隱性遺傳性疾病，主要累及男性個體Xp上抗營

15、養(yǎng)不良蛋白(dystrophin)基因突變引起的一組肌肉疾病 遺傳性疾病的概述和分子診斷1. Dystrophin基因 Dystrophin基因定位于Xp21，長達2 400 kb，有79個外顯子 DMD：dystrophin基因表現(xiàn)為顯著丟失甚至 缺失，臨床癥狀較重 BMD：dystrophin基因結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，但能 夠指導合成蛋白，癥狀較輕遺傳性疾病的概述和分子診斷2. Dystrophin基因的突變特征基因突變率較高 基因突變形式多樣缺失、點突變、重復、微小缺失或微小重復缺失和重復的熱點1) Dystrophin基因5端和中央?yún)^(qū)2) 小突變位于dystrophin基因的非編碼區(qū)遺傳性疾病

16、的概述和分子診斷3. DMD/BMD的基因診斷方法(1)基因缺失的檢測常用方法Southern印跡法多重PCR定量PCR 限制性內(nèi)切酶分析脈沖場凝膠電泳熒光原位雜交技術(shù)(FISH)多重連接依賴式探針擴增技術(shù)(MLPA)微陣列比較基因組雜交技術(shù)(array-CGH)遺傳性疾病的概述和分子診斷3. DMD/BMD的基因診斷方法(2) 基因點突變的檢測變性高效液相色譜分析(DHPLC)單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(SSCP)異源雙鏈多態(tài)分析(HA)化學錯配堿基裂解法(CMC)RT-套式PCR截短蛋白試驗和直接測序遺傳性疾病的概述和分子診斷3. DMD/BMD的基因診斷方法(3) 基因檢測應注意的問題檢測技術(shù)尚

17、難在一般實驗室普及檢測中應注意設(shè)置對照，做好質(zhì)量控制檢測前與患者溝通遺傳性疾病的概述和分子診斷二、多基因遺傳病的分子診斷遺傳性疾病的概述和分子診斷1.多基因遺傳病的概念 多基因遺傳(polygenic inheritance) 指生物和人類的許多表型性狀由不同座位的較多基因協(xié)同決定，而非單一基因的作用。遺傳性疾病的概述和分子診斷2.多基因遺傳特點基因微效性 多基因遺傳時，每對基因的性狀效應是微小的協(xié)同作用 不同微效基因可協(xié)同累加作用，導致表型產(chǎn)生環(huán)境因素 多基因遺傳表型受環(huán)境因素的影響，是基因與環(huán)境結(jié)合形成的一種性狀遺傳性疾病的概述和分子診斷2. 多基因遺傳病的分子診斷策略(1) 基因直接檢測

18、法 適用于已知基因異常的疾病(2) 基因間接檢測法 適用于致病基因已知，但其異常未知；或 致病基因本身未知 對受檢者及其家系進行連鎖分析，推測受 檢者是否獲得致病基因 遺傳性疾病的概述和分子診斷2. 多基因遺傳病的分子診斷糖尿病的分子診斷冠心病的分子診斷阿爾茨海默病的分子診斷遺傳性疾病的概述和分子診斷三、出生缺陷與產(chǎn)前診斷遺傳性疾病的概述和分子診斷（一）出生缺陷 指胚胎或胎兒在發(fā)育過程中發(fā)生的結(jié)構(gòu)或功能的異常。1.出生缺陷的類型畸形缺陷裂解缺陷發(fā)育不良變形缺陷遺傳性疾病的概述和分子診斷（一）出生缺陷2. 出生缺陷的發(fā)生因素源于受孕前的原因 染色體異常、單基因缺陷、多基因缺陷源于受孕后的原因 宮內(nèi)暴露環(huán)境因素不明原因遺傳性疾病的概述和分子診斷（二）產(chǎn)前診斷(prenatal diagnosis) 在胎兒期對先天性疾病或遺傳性疾病進行診斷 利用非侵入性或侵入性手段對胎兒進行特異 性檢查 判斷胎兒的染色體或基因是否正常 預防遺傳病患兒出生遺傳性疾病的概述和分子診斷1. 產(chǎn)前診斷的指征女方35歲，男方45歲不良妊娠史、不良生育史本人患遺傳病或家族中有遺傳病患者遺傳檢查異常超聲波檢查異常母親血清學篩查異常有毒物、射線接觸史孕期有病原感染史、服藥史遺傳性疾病的概述和分子診斷2. 產(chǎn)前分子診斷策略(1) 細胞遺傳學檢查經(jīng)典細胞遺傳學方法 染色體檢查或核型分析