第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppt-hylogen2022/10/30第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppt-hylogen2011.DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)（Watson＆Crick,1953）概論TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1962第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen21.DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)概論TheNobelPPresentationSpeechbyProfessorA.Engstr?m

Dr.FrancisCrick,Dr.JamesWatson,Yourdiscoveryofthemolecularstructureofthedeoxyribonucleicacid,thesubstancecarryingtheheredity,isofutmostimportanceforourunderstandingofoneofthemostvitalbiologicalprocesses.Practicallyallthescientificdisciplinesinthelifescienceshavefeltthegreatimpactofyourdiscovery.Theformulationofdoublehelicalstructureofthedeoxyribonucleicacidwiththespecificpairingoftheorganicbases,opensthemostspectacularpossibilitiesfortheunravellingofthedetailsofthecontrolandtransferofgeneticinformation.

第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen3PresentationSpeechbyProfess

CentralDogma2.中心法則提出（Crick，1958）Crick,1916-2004第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen4CentralDogma2.中心法則提出（Cri反轉(zhuǎn)錄機(jī)制闡明（Temin1970）補(bǔ)充的中心法則第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen5反轉(zhuǎn)錄機(jī)制闡明（Temin1970）補(bǔ)充的中心法則第七中心法則：代表了大多數(shù)生物遺傳信息貯存和表達(dá)的規(guī)律，奠定了從分子水平研究生命科學(xué)關(guān)鍵問(wèn)題的理論基礎(chǔ)。第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen6中心法則：代表了大多數(shù)生物遺傳信息貯存和表達(dá)的規(guī)律，奠定了3.基因表達(dá)（geneexpression）：

從DNA到蛋白質(zhì)，通過(guò)轉(zhuǎn)錄和翻譯，用基因的遺傳信息在細(xì)胞內(nèi)合成有功能意義的各種蛋白質(zhì)。第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen73.基因表達(dá)（geneexpression）：從D4.基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析技術(shù)：

Northernblot※Real-timeRT–PCR※基因芯片DNA序列分析※Southernblot※FISHDNARNAWesternblot※

蛋白質(zhì)芯片蛋白質(zhì)第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen84.基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析技術(shù)：Northernblot講授內(nèi)容：(Ⅰ)DNA序列分析※(Ⅱ)核酸分子雜交※(Ⅴ)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)※(Ⅲ)基因芯片和微陣列

(Ⅳ)

Western免疫印跡※第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen9講授內(nèi)容：(Ⅰ)DNA序列分析※(Ⅱ)核酸分子雜交※(Ⅴ)（一）雙脫氧鏈末端終止法※(Sanger,1977)（二）化學(xué)裂解法(Maxam＆Gilbert,1977)（三）DNA自動(dòng)化序列分析一、DNA序列分析第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen10（一）雙脫氧鏈末端終止法※一、DNA序列分析第七章基因結(jié)構(gòu)與DNA測(cè)序技術(shù)基礎(chǔ)：

●

高分辨率變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamidegelelectrophoresis,PAGE）技術(shù)

●

PAGE能分離長(zhǎng)度為300-500個(gè)堿基,差別僅1個(gè)堿基的單鏈寡核苷酸DNA片段。第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen11DNA測(cè)序技術(shù)基礎(chǔ)：●高分辨率變性聚丙烯酰胺凝(Sanger,UKMaxam＆Gilbert,USA)共同分享Nobel化學(xué)獎(jiǎng)(1979)第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen12(Sanger,UKMaxam＆Gilbert,USA(一）雙脫氧鏈末端終止法

（dideoxychaintermination）以DNA合成反應(yīng)為基礎(chǔ)。(Sanger)第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen13(一）雙脫氧鏈末端終止法

（dideoxychainte

ATP、dATP和ddATP的結(jié)構(gòu)ATPdATPddATP第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen14ATP、dATP和ddATP的結(jié)構(gòu)ATPdATPddATP

DNA合成反應(yīng)摻入N個(gè)核苷酸摻入N+1個(gè)核苷酸第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen15DNA合成反應(yīng)摻入N個(gè)核苷酸摻入N+1個(gè)核苷酸第七1.雙脫氧末端終止法原理

DNA合成反應(yīng)中，ddNTP不存在3′-OH末端，故不能與下一個(gè)核苷酸的5′-P端形成3′，5′-磷酸二酯鍵，導(dǎo)致DNA新鏈的延伸提前終止于ddNTP。第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen161.雙脫氧末端終止法原理DNA合成反應(yīng)中，

末端終止部位DNA單鏈模板引物延伸的新合成鏈摻入ddNTP第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen17末端終止部位DNA單鏈模板引物延伸的新合成鏈摻入d2.DNA測(cè)序主要步驟●變性聚丙烯酰胺凝膠電泳●單鏈DNA模板的制備

●

DNA模板與測(cè)序引物退火●摻入法標(biāo)記反應(yīng)●延伸-終止反應(yīng)●放射自顯影●閱讀測(cè)序結(jié)果第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen182.DNA測(cè)序主要步驟●變性聚丙烯酰胺凝膠電泳●測(cè)序步驟第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen19測(cè)序步驟第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthyloge第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen20第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen20G反應(yīng)管A反應(yīng)管C反應(yīng)管G反應(yīng)管T反應(yīng)管第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen21G反應(yīng)管A反應(yīng)管C反應(yīng)管G反應(yīng)管T反應(yīng)管第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)GATC第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen22GATC第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略p

與末端終止法不同，化學(xué)降解法是建立在對(duì)原有DNA的化學(xué)降解過(guò)程基礎(chǔ)上。

（二）化學(xué)裂解法第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen23與末端終止法不同，化學(xué)降解法是建立在對(duì)原有DNA的化

將待測(cè)DNA片段3′或5′端進(jìn)行同位素標(biāo)記，標(biāo)記的DNA片段分成四個(gè)反應(yīng)，分別用不同的化學(xué)試劑處理，造成堿基特異性切割，使DNA片段分別于某一種堿基處斷裂。1.化學(xué)裂解法原理第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen24將待測(cè)DNA片段3′或5′端進(jìn)行同位素標(biāo)記，標(biāo)記

化學(xué)降解G反應(yīng)模式圖硫酸二甲酯哌啶MetMetMetMet第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen25化學(xué)降解G反應(yīng)模式圖硫酸二甲酯哌啶MetMetMetMe（三）DNA測(cè)序自動(dòng)化原理

采用4種不同的熒光分別標(biāo)記4種ddNTP終止反應(yīng)產(chǎn)物，替代放射性同位素標(biāo)記是實(shí)現(xiàn)DNA測(cè)序自動(dòng)化的基礎(chǔ)。第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen26（三）DNA測(cè)序自動(dòng)化原理采用4種不同的1.DNA自動(dòng)測(cè)序步驟：

4種帶有不同熒光染料標(biāo)記的終止物ddNTPsSanger測(cè)序反應(yīng)反應(yīng)產(chǎn)物毛細(xì)管電泳分離第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen271.DNA自動(dòng)測(cè)序步驟：4種帶有不同熒光染料標(biāo)記的終止物

熒光信號(hào)采集、計(jì)算機(jī)分析與DNA自動(dòng)排序。

激光激發(fā)不同大小DNA片段上的熒光分子，發(fā)射出四種不同波長(zhǎng)的熒光第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen28熒光信號(hào)采集、計(jì)算機(jī)分析與DNA自動(dòng)排序。激光激發(fā)2.DNA自動(dòng)測(cè)序結(jié)果第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen292.DNA自動(dòng)測(cè)序結(jié)果第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略p(Ⅱ)核酸分子雜交NucleicAcidHybridization第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen30(Ⅱ)核酸分子雜交NucleicAcidHybridiz●細(xì)胞原位雜交（Pardueetal，1969)●Southern印跡雜交※:檢測(cè)DNA（SouthernEM，1975）●

Northern印跡雜交※:檢測(cè)RNA（StarkGR，1977）核酸分子雜交技術(shù)的建立第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen31●細(xì)胞原位雜交核酸分子雜交技術(shù)的建立第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)核酸分子雜交原理

標(biāo)記的單鏈核酸探針與待檢測(cè)的靶單鏈DNA或RNA局部互補(bǔ)結(jié)合形成雜交雙鏈。

應(yīng)用：核酸靶DNA或RNA序列的定性與定量分析。第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen32核酸分子雜交原理標(biāo)記的單鏈核酸探第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen33第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen33一、Southern印跡雜交

(Southernblothybridization)

將電泳分離的待測(cè)DNA片段結(jié)合到一定的固相支持物上，然后與存在于液相中標(biāo)記的核酸探針進(jìn)行雜交的過(guò)程。第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen34一、Southern印跡雜交

(SouthernblotPaperTowelsSouthernBlotting1tissueSDSProtKPhenolChloroETOHSpin第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen35PaperTowelsSouthernBlotting1AgaroseGelElectrophoresis_+3第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen36AgaroseGelElectrophoresis_+3二、Northern印跡雜交

(Northernblothybridization)指將RNA變性及電泳分離后，并轉(zhuǎn)移到固相支持物上，用雜交反應(yīng)來(lái)鑒定其中特定mRNA分子的含量及其大小。第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen37二、Northern印跡雜交

(NorthernblotRNA瓊脂糖凝膠電泳3kb0.4kbNt36382604623Northernblothybridization28S18S應(yīng)用舉例第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen38RNA瓊脂糖凝膠電泳3kbNtNorthernblothGAPDH0d2d4d6d8dNorthernblot雜交分析mRNA的表達(dá)靶mRNA第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen390d2d4d6d8dNo三、其他雜交技術(shù)(一)斑點(diǎn)雜交(dotblothybridization）:

將RNA或DNA變性后直接點(diǎn)樣于硝酸纖維素膜或尼龍膜上，用于基因組中特定基因及其表達(dá)的定性及定量研究?！瘛瘛瘛瘛瘛竦谄哒禄蚪Y(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen40三、其他雜交技術(shù)(一)斑點(diǎn)雜交(dotblothybr（二）原位雜交

（insituhybridization）用標(biāo)記的核酸探針與組織切片或細(xì)胞中的待測(cè)核酸互補(bǔ)序列雜交，可對(duì)核酸進(jìn)行定性、定位和相對(duì)定量分析。

第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen41（二）原位雜交

（insituhybridization（三）液相雜交

(solutionhybridization)

1．核酸酶S1保護(hù)分析法

(nucleaseS1protectionassay）

單鏈DNA探針與待測(cè)RNA形成DNA/RNA雜交雙鏈，加入核酸酶S1專(zhuān)一性地降解未形成雜交體的DNA或RNA單鏈，DNA/RNA雜交雙鏈則受到保護(hù)而不被降解。第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen42（三）液相雜交

(solutionhybridizat2．RNA酶保護(hù)分析法

（RNaseprotectionassay，RPA）第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen432．RNA酶保護(hù)分析法第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppRPA基本程序：●待測(cè)RNA的分離●體外轉(zhuǎn)錄標(biāo)記RNA探針●待測(cè)RNA與探針RNA進(jìn)行液相雜交●RNA酶消化●不同大小雜交片段凝膠電泳分離第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen44RPA基本程序：●待測(cè)RNA的分離第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的3.抑制消減雜交原理

（suppressionsubtractivehybridization，SSH）

以雜交為基礎(chǔ)，并與PCR技術(shù)結(jié)合的cDNA消減雜交方法。

應(yīng)用：差異表達(dá)新基因的篩選與克隆。第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen453.抑制消減雜交原理

（suppressionsubtrSSH原理第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen46SSH原理第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylog

cDNAChipandMicroarray

(Ⅲ)

基因芯片和微陣列第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen47cDNAChipandMicroarray(Ⅲ)●基因芯片上的陣列是由有規(guī)則排列的cDNA或寡核苷酸等樣本所組成的?！窕虮磉_(dá)高通量分析法。第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen48●基因芯片上的陣列是由有DNA微陣列：●cDNA微陣列（cDNAmicroarray）●寡核苷酸微陣列（oligomicroarray）第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen49DNA微陣列：第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylcDNA微陣列:

在一微小的基片（硅片等）表面集成了大量分子識(shí)別探針，能夠平行分析大量基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)，因此又被稱(chēng)為cDNA芯片。第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen50cDNA微陣列:第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthy基因表達(dá)譜芯片主要技術(shù)流程：樣品熒光標(biāo)記芯片制備芯片雜交芯片洗滌和掃描掃描圖像分析102第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen51基因表達(dá)譜芯片主要技術(shù)流程：樣品熒光標(biāo)記102第七章基因結(jié)構(gòu)核酸雜交技術(shù)和微陣列芯片克隆DNAcDNA標(biāo)記陣列(Array,Macroarray)雜交、顯影高密度微陣列(Microarray)103第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen52核酸雜交技術(shù)和微陣列芯片克隆DNAcDNA標(biāo)記陣列(ArraCBACy5-標(biāo)記cDNACy3-標(biāo)記cDNACBACBACBACBACBACBA樣品1樣品2Cy5/Cy3熒光標(biāo)記RNA提取競(jìng)爭(zhēng)性雜交顯示基因表達(dá)量差異二種樣品競(jìng)爭(zhēng)性雜交示意圖基因表達(dá)譜芯片的原理104第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen53CBACy5-標(biāo)記Cy3-標(biāo)記CBACBACBACBACBA生物學(xué)問(wèn)題提出，表達(dá)基因分析，樣本分類(lèi)與實(shí)驗(yàn)預(yù)測(cè).實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)基因芯片實(shí)驗(yàn)圖象分析結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化基因表達(dá)譜芯片研究應(yīng)用思路105第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen54生物學(xué)問(wèn)題提出，表達(dá)基因分析，樣本分類(lèi)與實(shí)驗(yàn)預(yù)測(cè)基因表達(dá)譜芯某些基因表達(dá)異?；虼嬖诓町惿飳W(xué)確證和解釋分析下一步實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen55某些基因表達(dá)異?；虼嬖诓町惿飳W(xué)確證和解釋分析下一步實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)●

cDNA芯片可定量監(jiān)測(cè)大量基因表達(dá)水平，闡述基因功能，探索疾病原因及機(jī)制、發(fā)現(xiàn)診斷及治療靶基因等。cDNA芯片在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用●Northernblot或RT-PCR驗(yàn)證?！窕虮磉_(dá)數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)分析。第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen56●cDNA芯片可定量監(jiān)測(cè)大量基因表達(dá)水cDNA芯片在(Ⅳ)Western免疫印跡Westernblot原理與核酸分子雜交相似，只是以偶聯(lián)標(biāo)記物的抗體分子作為探針，檢測(cè)轉(zhuǎn)移到固相支持物上的蛋白質(zhì)分子。第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen57(Ⅳ)Western免疫印跡West第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen58第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen58Westernblot程序：●蛋白質(zhì)樣品制備

●

SDS分離

●蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜●標(biāo)記抗體與膜上蛋白質(zhì)抗原雜交

●檢測(cè)并分析標(biāo)記物信號(hào)第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen59Westernblot程序：第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本W(wǎng)estern免疫印跡信號(hào)檢測(cè)原理第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen60Western免疫印跡信號(hào)檢測(cè)原理第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的

Luminol化學(xué)發(fā)光原理

第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen61Luminol化學(xué)發(fā)光原理第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本另一種信號(hào)顯示方法是在洗去一抗后，加入堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗，再用BCIP／NBT在膜上直接顯色。第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen62另一種信號(hào)顯示方法是在洗去一抗后，加入堿性磷酸酶標(biāo)記免疫沉淀技術(shù)

是一種抗原抗體反應(yīng)技術(shù)，只是將抗體分子先結(jié)合到固相載體如磁珠上，然后與含目標(biāo)蛋白的細(xì)胞裂解液進(jìn)行液相雜交反應(yīng)，利用磁場(chǎng)或離心等技術(shù)將結(jié)含在抗體上的蛋白質(zhì)收集起來(lái)，電泳分離，用于Westernblot分析。第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen63免疫沉淀技術(shù)第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylo(Ⅴ)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PolymeraseChainReaction第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen64(Ⅴ)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PolymeraseChainRe引言●

PCR技術(shù)發(fā)明（1985，MullisK.）●

PCR及其相關(guān)技術(shù)發(fā)展速度驚人、應(yīng)用迅速?gòu)V泛（分子生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、生物學(xué)、考古學(xué)等學(xué)科領(lǐng)域）●獲Nobel化學(xué)獎(jiǎng)（1993，MullisK.）第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen65引言●PCR技術(shù)發(fā)明（1985，MullisK.）第七章講授內(nèi)容提要:一、PCR技術(shù)原理二、耐熱DNA聚合酶三、PCR引物及設(shè)計(jì)原則四、PCR條件的優(yōu)化五、PCR改進(jìn)技術(shù)第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen66講授內(nèi)容提要:一、PCR技術(shù)原理二、耐熱DNA聚合酶三、PC聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR):一、PCR技術(shù)原理

Mullis

K.1985年發(fā)明的一種模擬天然DNA復(fù)制過(guò)程的核酸體外擴(kuò)增技術(shù)。

TheNobelPrizeinChemistry1993第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen67聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR):一、PCR技術(shù)原理DNA復(fù)制●半保留復(fù)制●半不連續(xù)復(fù)制●岡崎片段領(lǐng)頭鏈隨從鏈第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen68DNA復(fù)制●半保留復(fù)制●半不連續(xù)復(fù)制●岡崎片段領(lǐng)頭鏈隨從鏈第引物的化學(xué)本質(zhì)是什么？單鏈寡核苷酸DNA或RNA片段。DNA復(fù)制引物：?jiǎn)捂淩NA片段PCR引物：?jiǎn)捂淒NA片段第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen69引物的化學(xué)本質(zhì)是什么？單鏈寡核苷酸DNA或RNA片段。DNA（一）PCR基本過(guò)程1.PCR循環(huán)由三步組成：①變性（denaturation）②退火（annealing）③延伸（extension）第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen70（一）PCR基本過(guò)程1.PCR循環(huán)由三步組成：①變性（dPCR原理低溫退火高溫變性中溫延伸第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen71PCR原理低溫退火高溫變性中溫延伸第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的

在模板DNA、引物、4種dNTP存在條件下，依賴(lài)DNA聚合酶催化一對(duì)引物間特異DNA片段合成的體外擴(kuò)增技術(shù)。

2.PCR定義：第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen72在模板DNA、引物、4種dNTP3.PCR擴(kuò)增終產(chǎn)物大小:介于兩條退火引物5′末端之間的雙鏈DNA片段。第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen733.PCR擴(kuò)增終產(chǎn)物大小:介于兩條退火引物5′末4.什么叫引物延伸產(chǎn)物？

比兩引物限定區(qū)長(zhǎng)的延伸產(chǎn)物。僅發(fā)生在以原始模板DNA為模板的擴(kuò)增過(guò)程中，以倍數(shù)形式擴(kuò)增(2n)。第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen744.什么叫引物延伸產(chǎn)物？比兩引物限Y=A（1+E）n

Y:擴(kuò)增產(chǎn)物的量

A:最初靶DNA分子數(shù)

E:PCR擴(kuò)增效率

n:循環(huán)次數(shù)

5.PCR產(chǎn)量

當(dāng)E＝100％,A=1時(shí)

Y=2n>>2n(引物延伸產(chǎn)物的量）第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen75Y=A（1+E）n5.PCR產(chǎn)量當(dāng)E＝1PCRthermalcyclerRotor-Gene第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen76PCRthermalcyclerRotor-Gene第七PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen77PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本（二）平臺(tái)期與平臺(tái)效應(yīng)

1.平臺(tái)效應(yīng)（plateaueffect）：

PCR經(jīng)過(guò)一定數(shù)量的循環(huán)后，DNA片段不再呈指數(shù)累積，而是進(jìn)入靜止期即平臺(tái)期。第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen78（二）平臺(tái)期與平臺(tái)效應(yīng)

1.平臺(tái)效應(yīng)（plateauefPCR平臺(tái)效應(yīng)第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen79PCR平臺(tái)效應(yīng)第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthyl2.平臺(tái)期影響因素：①引物及dNTP底物濃度降低。②酶與模板比例下降。實(shí)際應(yīng)用提示：定量PCR應(yīng)考慮平臺(tái)期效應(yīng)，選擇最適循環(huán)次數(shù)。第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen802.平臺(tái)期影響因素：①引物及dNTP底物濃度降低。二、耐熱DNA聚合酶（三）高保真的耐熱DNA聚合酶（二）TaqDNA聚合酶（一）PCR耐熱DNA聚合酶的發(fā)現(xiàn)第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen81二、耐熱DNA聚合酶（三）高保真的耐熱DNA聚合酶（二）Ta（一）PCR耐熱DNA聚合酶的發(fā)現(xiàn)

2.T4與T7DNA聚合酶:熱穩(wěn)定性差。1.

大腸桿菌DNA聚合酶ⅠKlenow片段：

①熱穩(wěn)定性差，不耐高溫。

②反應(yīng)溫度偏低，產(chǎn)生非特異擴(kuò)增。3.TaqDNA聚合酶:實(shí)現(xiàn)了PCR自動(dòng)化第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen82（一）PCR耐熱DNA聚合酶的發(fā)現(xiàn)2.T4與T7（二）TaqDNA聚合酶從嗜熱水生菌thermusaquaticsYT-1株中直接分離出來(lái)。

基因全長(zhǎng):2,496bp

編碼蛋白質(zhì):832個(gè)AA,94kdC端結(jié)構(gòu)域:5′→3′外切酶活性N端結(jié)構(gòu)域:聚合酶活性HOOCNH2第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen83（二）TaqDNA聚合酶從嗜熱水生菌1.較高的熱穩(wěn)定性●

95℃的半衰期:40min●最適溫度:72℃～80℃

●催化反應(yīng)速率:150～300核苷酸/秒/酶分子第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen841.較高的熱穩(wěn)定性●95℃的半衰期:40mTaqDNA聚合酶特性：●5′→3′聚合酶活性；●5′→3′外切酶活性；●逆轉(zhuǎn)錄酶活性；●較弱的非模板依賴(lài)性；●缺乏3′→5′外切酶活性。第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen85TaqDNA聚合酶特性：●5′→3′聚合酶活性；第七章2.無(wú)機(jī)離子及抑制劑

TaqDNA聚合酶的活性對(duì)Mg2+濃度和單價(jià)離子（K+或NH4+）的性質(zhì)和濃度較敏感。最適Mg2+濃度：2mmol/L

K+濃度：50mmol/L第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen862.無(wú)機(jī)離子及抑制劑TaqDN3.保真性DNA聚合酶3′→5′外切酶活性核苷酸的錯(cuò)誤摻入率T4DNA聚合酶＋1/260000T7DNA聚合酶＋1/190000Klenow片段±1/140000TaqDNA聚合酶－1/41000第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen873.保真性3′→5′外切酶活性核苷酸的錯(cuò)誤摻入率T4D如何提高PCRDNA聚合酶的保真性？①使用TaqDNA聚合酶時(shí)，摻入少量具有3′→5′外切酶活性的耐熱DNA聚合酶,錯(cuò)配率可降為原來(lái)的1/10；②使四種dNTP底物濃度相等；③MgCl2濃度盡可能低；④

減少循環(huán)數(shù)。第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen88如何提高PCRDNA聚合酶的保真性？①使用TaqDNA（三）幾種高保真的耐熱DNA聚合酶1.TthDNA聚合酶2.VentDNA聚合酶3.PfuDNA聚合酶第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen89（三）幾種高保真的耐熱DNA聚合酶1.TthDN三、PCR引物及設(shè)計(jì)原則（一）引物設(shè)計(jì)原則（二）引物用量計(jì)算第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen90三、PCR引物及設(shè)計(jì)原則（一）引物設(shè)計(jì)原則（二）引物用量計(jì)算（一）引物設(shè)計(jì)原則

引物序列及其與模板特異性結(jié)合是決定PCR反應(yīng)結(jié)果的關(guān)鍵。第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen91（一）引物設(shè)計(jì)原則引物序列及其與模板1.引物設(shè)計(jì)原則:①引物長(zhǎng)度:10～30Nt②堿基分布:A、T、G、C隨機(jī)分布

③G+C含量：40～60%

Tm=4(G+C)+2(A+T)④引物之間：避免3′端互補(bǔ)第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen921.引物設(shè)計(jì)原則:①引物長(zhǎng)度:10～30Nt②堿基⑤引物自身：不應(yīng)形成二級(jí)結(jié)構(gòu)⑦引物5′末端堿基:可不與模板DNA互補(bǔ)⑥引物3′末端堿基：最好選T、C、G，不選A第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen93⑤引物自身：不應(yīng)形成二級(jí)結(jié)構(gòu)⑦引物5′末端堿基:可不與模板引物5′端修飾技術(shù)附加核酸序列用途

限制酶位點(diǎn)克?。ㄈ缍ㄏ蚩寺。┦删w啟動(dòng)子合成RNA探針、測(cè)序蛋白質(zhì)結(jié)合序列產(chǎn)物純化、檢測(cè)核糖體結(jié)合序列高效表達(dá)加錯(cuò)配堿基造成突變定點(diǎn)誘變第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen94引物5′端修飾技術(shù)第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppth2.簡(jiǎn)并引物（degenerateprimers）:針對(duì)某一基因編碼蛋白的氨基酸區(qū)域設(shè)計(jì)的一組堿基序列不同，但有相同堿基數(shù)的寡核苷酸混合物。第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen952.簡(jiǎn)并引物（degenerateprimers）:簡(jiǎn)并引物設(shè)計(jì)及應(yīng)用：

①對(duì)純化的未知蛋白測(cè)定一段短氨基酸序列。②不同物種某一基因編碼的保守

氨基酸區(qū)域。應(yīng)用：基于簡(jiǎn)并引物PCR策略克隆新基因第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen96簡(jiǎn)并引物設(shè)計(jì)及應(yīng)用：①對(duì)純化的未知蛋白測(cè)定一段短3.引物設(shè)計(jì)缺陷而引起的后果第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen973.引物設(shè)計(jì)缺陷而引起的后果第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策4.優(yōu)化的引物設(shè)計(jì)實(shí)例上游引物序列：5′GAGAACATGGTGCGCAGGTT3′下游引物序列：5′TGCCCATCATCATGACCTGG

3′第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen984.優(yōu)化的引物設(shè)計(jì)實(shí)例上游引物序列：第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分5′

CAGTTAAGGGGGCAGGAGTGGCGCTGCTCACCTCTGGTGCCAAAGGGCGGCGCAGCGGCTGCCGAGCTCGGCCCTGGAGGCGGC

AGAACATGGTGCGCAGGTTCTTGGTGACCCTCCGGATTCGGCGCGCGTGCGGCCCGCCGCGAGTGAGGGTTTTCGTGGTTCACATCCCGCGGCTCACGGGGGAGTGGGCAGCGCCAGGGGCGCCCGCCGCTGTGGCCCTCGTGCTGATGCTACTGAGGAGCCAGCGTCTAGGGCAGCAGCCGCTTCCTAGAAGACCAGGTCATGATGATGGGCAGCGCCCG

GGTCCAGTACTACTACCCGT

AGTGGCGGAGCTGCTGCTGCTCCACGGCGCGGAGCCCAACTGCGCCGACCCC3′第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen995′CAGTTAAGGGGGCAGGAGTGGCGCTGC1A260oligoDNA≈33μgN:引物堿基數(shù)X：合成的oligoDNAA260單位Y：引物的pmol數(shù)

106

Y（pmol）=X·33×──330.N

X=──×105

N(二)引物用量計(jì)算第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen1001A260oligoDNA≈33μg

四、PCR條件的優(yōu)化(一)

TaqDNA聚合酶濃度：

1.0～2.5U/100μl反應(yīng)液

(二)dNTP濃度：20～200μmol/L

(三)Mg2+濃度：0.5～2.5mmol/L

(四)

引物濃度：0.1～0.5μmol/L第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen101四、PCR條件的優(yōu)化(一)TaqDNA聚合酶濃度：(二PCR應(yīng)用舉例①遺傳病診斷：鐮狀細(xì)胞貧血β6GluVal(GAGGUG)PCR擴(kuò)增β6DNA區(qū)域②傳染病診斷：HBV和HIV③腫瘤分子標(biāo)志診斷:bcr-ablPML/RARα④個(gè)體識(shí)別:親子鑒定與刑事偵破⑤生物考古第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen102PCR應(yīng)用舉例①遺傳病診斷：鐮狀細(xì)胞貧血第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)五、PCR改進(jìn)技術(shù)（一）RT-PCR(reversetranscriptionPCR)以mRNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再以此cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen103五、PCR改進(jìn)技術(shù)（一）RT-PCR以mRNA為RT-PCR原理第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen104RT-PCR原理第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthy逆轉(zhuǎn)錄酶①AMV（avianmyeloblastosisvirus）酶活性最適溫度42℃②MMLV（Moloneymurineleukemiavirus）：最適溫度37℃第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen105逆轉(zhuǎn)錄酶①AMV（avianmyeloblastosis（二）

定量RT-PCR（QRT-PCR）PCR擴(kuò)增指數(shù)期內(nèi)極小的擴(kuò)增效率改變會(huì)極大地影響產(chǎn)量。1.半定量RT-PCR

以樣本mRNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，在不同引物對(duì)引導(dǎo)下共同PCR擴(kuò)增“看家”基因和目的基因cDNA。第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen106（二）定量RT-PCR（QRT-PCR）PCR擴(kuò)增指數(shù)期內(nèi)

①選擇內(nèi)對(duì)照基因組織中普遍表達(dá)、表達(dá)量比較恒定的“看家”基因mRNA。如GAPDH和β-actinmRNA等。②半定量標(biāo)準(zhǔn)

計(jì)算PCR產(chǎn)物：

靶cDNA/GAPDHcDNA第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen107①選擇內(nèi)對(duì)照基因②半定量標(biāo)準(zhǔn)第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的

RT-PCR驗(yàn)證G-Rh2誘導(dǎo)TNFαmRNA表達(dá)上調(diào)25μmol/LG-Rh2

12h24h48h72h－+－+－+－+TNFαGAPDH

③舉例第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen108RT-PCR驗(yàn)證G-Rh2誘導(dǎo)TNFαmRNA表達(dá)上2.Real-timeRT-PCR原理：

PCR體系加入一種雙色熒光標(biāo)記的寡核苷酸探針，根據(jù)探針上熒光信號(hào)的變化，計(jì)算模板DNA的含量。第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen109第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen109實(shí)時(shí)PCR應(yīng)用：用于基因DNA拷貝數(shù)和mRNA表達(dá)定量分析。第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen110實(shí)時(shí)PCR應(yīng)用：用于基因DNA拷貝數(shù)和定量檢測(cè)PCR產(chǎn)物的指示系統(tǒng):

TaqMan和MolecularBeacon，均依賴(lài)熒光共振能量轉(zhuǎn)移（fluorescenceresonanceenergytransfer，F(xiàn)RET）。第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen111定量檢測(cè)PCR產(chǎn)物的指示系統(tǒng):第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本①

TaqManProbe

●寡核苷酸探針的5′端標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光染料（reporterfluorescencedye），3′端標(biāo)記一個(gè)淬滅染料（quencherdye）。第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen112①TaqManProbe●●當(dāng)光源照射到探針時(shí)，被激發(fā)的報(bào)告熒光染料將能量轉(zhuǎn)移給附近的淬滅染料而不發(fā)光。第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen113●當(dāng)光源照射到探針時(shí)，被激發(fā)的報(bào)告熒光染料將能量轉(zhuǎn)第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen114第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen114RQ5’3’5’3’5’3’5’3’ExcitationRQQRQRExcitation雙標(biāo)記探針（TaqmanProbe）5′5′5′3′3′第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen115RQ5’3’5’3’5’3’5’3’ExcitationRQ●當(dāng)PCR擴(kuò)增時(shí)，TaqDNA聚合酶遇到結(jié)合在模板上的TaqMan探針時(shí)，其5′→3′外切酶活性將探針切掉，使報(bào)告熒光染料與淬滅染料分離，熒光共振能量轉(zhuǎn)移不再發(fā)生。第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen116●當(dāng)PCR擴(kuò)增時(shí)，TaqDNA聚合酶遇到結(jié)

●報(bào)告熒光所發(fā)射的熒光強(qiáng)度與被切掉的探針成正比，由此計(jì)算PCR產(chǎn)物的含量。第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen117●報(bào)告熒光所發(fā)射的熒光強(qiáng)度與被切掉的探針成正比，由此計(jì)

用相同模板量的不同樣本進(jìn)行TaqManPCR擴(kuò)增時(shí)，相同時(shí)間分析熒光強(qiáng)度，可以發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物含量的差異。舉例：第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen118用相同模板量的不同樣本進(jìn)行TaqManP。②MolecularBeaconProbe●該探針具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)，5′端標(biāo)記報(bào)告熒光染料，3′端標(biāo)記淬滅染料。

●探針與靶序列雜交結(jié)合，報(bào)告熒光染料與淬滅染料分離，發(fā)出熒光。第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen119。②MolecularBeaconProbe第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen120第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen120●MolecularBeacon探針加入到PCR擴(kuò)增體系中，每次循環(huán)都與靶序列結(jié)合，隨著PCR產(chǎn)物的增加，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，由此定量PCR產(chǎn)物的含量第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen121●MolecularBeacon探針加入到PC③

探針設(shè)計(jì)的原則：

●PCR擴(kuò)增片段大?。盒∮?00bp;

●探針不能和任一引物互補(bǔ);

●探針長(zhǎng)度：小于30Nt;

●探針盡可能的靠近引物。第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen122③探針設(shè)計(jì)的原則：第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppt④熒光定量PCR儀帶有激發(fā)光源和熒光信號(hào)檢測(cè)系統(tǒng)的PCR儀，配有電腦系統(tǒng)及分析軟件。第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen123④熒光定量PCR儀第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略pp⑤熒光定量PCR應(yīng)用舉例

●傳染病診斷、監(jiān)測(cè)與療效預(yù)后評(píng)估：HBV和HIV

●揭示疾病發(fā)病機(jī)制第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen124⑤熒光定量PCR應(yīng)用舉例●傳染病診斷、監(jiān)測(cè)與療效預(yù)后評(píng)（三）其它PCR技術(shù)1.反向PCR（inversePCR）原理

第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen125（三）其它PCR技術(shù)1.反向PCR（inversePCR2.Alu-PCR

第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen1262.Alu-PCR第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略pp3.原位PCR(in-situPCR)4.巢式PCR（nestedPCR）5.不對(duì)稱(chēng)PCR（asymmetricPCR）第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen1273.原位PCR(in-situPCR)第七章基因結(jié)構(gòu)與表6.cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)

第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen1286.cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基7.PCR單鏈構(gòu)象多態(tài)性

（PCR-singlestrandconformation

polymorphism,PCR-SSCP）

第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen1297.PCR單鏈構(gòu)象多態(tài)性

（PCR-singlestra

分析基因可在DNA、RNA或蛋白質(zhì)水平上進(jìn)行,要基于研究目的,善于將各種技術(shù)有機(jī)地結(jié)合起來(lái)，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)技術(shù)路線(xiàn)的設(shè)計(jì),開(kāi)展基因結(jié)構(gòu)與功能表達(dá)的創(chuàng)新性研究。小結(jié)第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen130分析基因可在DNA、RNA或蛋白質(zhì)水平上進(jìn)行,要演講完畢，謝謝聽(tīng)講!再見(jiàn)，seeyouagain3rew2022/10/30第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen演講完畢，謝謝聽(tīng)講!再見(jiàn)，seeyouagain3rew131第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppt-hylogen2022/10/30第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppt-hylogen201321.DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)（Watson＆Crick,1953）概論TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1962第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen1331.DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)概論TheNobelPPresentationSpeechbyProfessorA.Engstr?m

Dr.FrancisCrick,Dr.JamesWatson,Yourdiscoveryofthemolecularstructureofthedeoxyribonucleicacid,thesubstancecarryingtheheredity,isofutmostimportanceforourunderstandingofoneofthemostvitalbiologicalprocesses.Practicallyallthescientificdisciplinesinthelifescienceshavefeltthegreatimpactofyourdiscovery.Theformulationofdoublehelicalstructureofthedeoxyribonucleicacidwiththespecificpairingoftheorganicbases,opensthemostspectacularpossibilitiesfortheunravellingofthedetailsofthecontrolandtransferofgeneticinformation.

第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen134PresentationSpeechbyProfess

CentralDogma2.中心法則提出（Crick，1958）Crick,1916-2004第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen135CentralDogma2.中心法則提出（Cri反轉(zhuǎn)錄機(jī)制闡明（Temin1970）補(bǔ)充的中心法則第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen136反轉(zhuǎn)錄機(jī)制闡明（Temin1970）補(bǔ)充的中心法則第七中心法則：代表了大多數(shù)生物遺傳信息貯存和表達(dá)的規(guī)律，奠定了從分子水平研究生命科學(xué)關(guān)鍵問(wèn)題的理論基礎(chǔ)。第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen137中心法則：代表了大多數(shù)生物遺傳信息貯存和表達(dá)的規(guī)律，奠定了3.基因表達(dá)（geneexpression）：

從DNA到蛋白質(zhì)，通過(guò)轉(zhuǎn)錄和翻譯，用基因的遺傳信息在細(xì)胞內(nèi)合成有功能意義的各種蛋白質(zhì)。第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen1383.基因表達(dá)（geneexpression）：從D4.基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析技術(shù)：

Northernblot※Real-timeRT–PCR※基因芯片DNA序列分析※Southernblot※FISHDNARNAWesternblot※

蛋白質(zhì)芯片蛋白質(zhì)第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen1394.基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析技術(shù)：Northernblot講授內(nèi)容：(Ⅰ)DNA序列分析※(Ⅱ)核酸分子雜交※(Ⅴ)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)※(Ⅲ)基因芯片和微陣列

(Ⅳ)

Western免疫印跡※第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen140講授內(nèi)容：(Ⅰ)DNA序列分析※(Ⅱ)核酸分子雜交※(Ⅴ)（一）雙脫氧鏈末端終止法※(Sanger,1977)（二）化學(xué)裂解法(Maxam＆Gilbert,1977)（三）DNA自動(dòng)化序列分析一、DNA序列分析第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen141（一）雙脫氧鏈末端終止法※一、DNA序列分析第七章基因結(jié)構(gòu)與DNA測(cè)序技術(shù)基礎(chǔ)：

●

高分辨率變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamidegelelectrophoresis,PAGE）技術(shù)

●

PAGE能分離長(zhǎng)度為300-500個(gè)堿基,差別僅1個(gè)堿基的單鏈寡核苷酸DNA片段。第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen142DNA測(cè)序技術(shù)基礎(chǔ)：●高分辨率變性聚丙烯酰胺凝(Sanger,UKMaxam＆Gilbert,USA)共同分享Nobel化學(xué)獎(jiǎng)(1979)第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen143(Sanger,UKMaxam＆Gilbert,USA(一）雙脫氧鏈末端終止法

（dideoxychaintermination）以DNA合成反應(yīng)為基礎(chǔ)。(Sanger)第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen144(一）雙脫氧鏈末端終止法

（dideoxychainte

ATP、dATP和ddATP的結(jié)構(gòu)ATPdATPddATP第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen145ATP、dATP和ddATP的結(jié)構(gòu)ATPdATPddATP

DNA合成反應(yīng)摻入N個(gè)核苷酸摻入N+1個(gè)核苷酸第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen146DNA合成反應(yīng)摻入N個(gè)核苷酸摻入N+1個(gè)核苷酸第七1.雙脫氧末端終止法原理

DNA合成反應(yīng)中，ddNTP不存在3′-OH末端，故不能與下一個(gè)核苷酸的5′-P端形成3′，5′-磷酸二酯鍵，導(dǎo)致DNA新鏈的延伸提前終止于ddNTP。第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen1471.雙脫氧末端終止法原理DNA合成反應(yīng)中，

末端終止部位DNA單鏈模板引物延伸的新合成鏈摻入ddNTP第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen148末端終止部位DNA單鏈模板引物延伸的新合成鏈摻入d2.DNA測(cè)序主要步驟●變性聚丙烯酰胺凝膠電泳●單鏈DNA模板的制備

●

DNA模板與測(cè)序引物退火●摻入法標(biāo)記反應(yīng)●延伸-終止反應(yīng)●放射自顯影●閱讀測(cè)序結(jié)果第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen1492.DNA測(cè)序主要步驟●變性聚丙烯酰胺凝膠電泳●測(cè)序步驟第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen150測(cè)序步驟第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthyloge第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen151第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen20G反應(yīng)管A反應(yīng)管C反應(yīng)管G反應(yīng)管T反應(yīng)管第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen152G反應(yīng)管A反應(yīng)管C反應(yīng)管G反應(yīng)管T反應(yīng)管第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)GATC第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen153GATC第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略p

與末端終止法不同，化學(xué)降解法是建立在對(duì)原有DNA的化學(xué)降解過(guò)程基礎(chǔ)上。

（二）化學(xué)裂解法第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen154與末端終止法不同，化學(xué)降解法是建立在對(duì)原有DNA的化

將待測(cè)DNA片段3′或5′端進(jìn)行同位素標(biāo)記，標(biāo)記的DNA片段分成四個(gè)反應(yīng)，分別用不同的化學(xué)試劑處理，造成堿基特異性切割，使DNA片段分別于某一種堿基處斷裂。1.化學(xué)裂解法原理第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen155將待測(cè)DNA片段3′或5′端進(jìn)行同位素標(biāo)記，標(biāo)記

化學(xué)降解G反應(yīng)模式圖硫酸二甲酯哌啶MetMetMetMet第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen156化學(xué)降解G反應(yīng)模式圖硫酸二甲酯哌啶MetMetMetMe（三）DNA測(cè)序自動(dòng)化原理

采用4種不同的熒光分別標(biāo)記4種ddNTP終止反應(yīng)產(chǎn)物，替代放射性同位素標(biāo)記是實(shí)現(xiàn)DNA測(cè)序自動(dòng)化的基礎(chǔ)。第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen157（三）DNA測(cè)序自動(dòng)化原理采用4種不同的1.DNA自動(dòng)測(cè)序步驟：

4種帶有不同熒光染料標(biāo)記的終止物ddNTPsSanger測(cè)序反應(yīng)反應(yīng)產(chǎn)物毛細(xì)管電泳分離第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen1581.DNA自動(dòng)測(cè)序步驟：4種帶有不同熒光染料標(biāo)記的終止物

熒光信號(hào)采集、計(jì)算機(jī)分析與DNA自動(dòng)排序。

激光激發(fā)不同大小DNA片段上的熒光分子，發(fā)射出四種不同波長(zhǎng)的熒光第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen159熒光信號(hào)采集、計(jì)算機(jī)分析與DNA自動(dòng)排序。激光激發(fā)2.DNA自動(dòng)測(cè)序結(jié)果第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen1602.DNA自動(dòng)測(cè)序結(jié)果第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略p(Ⅱ)核酸分子雜交NucleicAcidHybridization第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen161(Ⅱ)核酸分子雜交NucleicAcidHybridiz●細(xì)胞原位雜交（Pardueetal，1969)●Southern印跡雜交※:檢測(cè)DNA（SouthernEM，1975）●

Northern印跡雜交※:檢測(cè)RNA（StarkGR，1977）核酸分子雜交技術(shù)的建立第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen162●細(xì)胞原位雜交核酸分子雜交技術(shù)的建立第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)核酸分子雜交原理

標(biāo)記的單鏈核酸探針與待檢測(cè)的靶單鏈DNA或RNA局部互補(bǔ)結(jié)合形成雜交雙鏈。

應(yīng)用：核酸靶DNA或RNA序列的定性與定量分析。第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen163核酸分子雜交原理標(biāo)記的單鏈核酸探第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen164第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen33一、Southern印跡雜交

(Southernblothybridization)

將電泳分離的待測(cè)DNA片段結(jié)合到一定的固相支持物上，然后與存在于液相中標(biāo)記的核酸探針進(jìn)行雜交的過(guò)程。第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen165一、Southern印跡雜交

(SouthernblotPaperTowelsSouthernBlotting1tissueSDSProtKPhenolChloroETOHSpin第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen166PaperTowelsSouthernBlotting1AgaroseGelElectrophoresis_+3第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen167AgaroseGelElectrophoresis_+3二、Northern印跡雜交

(Northernblothybridization)指將RNA變性及電泳分離后，并轉(zhuǎn)移到固相支持物上，用雜交反應(yīng)來(lái)鑒定其中特定mRNA分子的含量及其大小。第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen168二、Northern印跡雜交

(NorthernblotRNA瓊脂糖凝膠電泳3kb0.4kbNt36382604623Northernblothybridization28S18S應(yīng)用舉例第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen169RNA瓊脂糖凝膠電泳3kbNtNorthernblothGAPDH0d2d4d6d8dNorthernblot雜交分析mRNA的表達(dá)靶mRNA第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen1700d2d4d6d8dNo三、其他雜交技術(shù)(一)斑點(diǎn)雜交(dotblothybridization）:

將RNA或DNA變性后直接點(diǎn)樣于硝酸纖維素膜或尼龍膜上，用于基因組中特定基因及其表達(dá)的定性及定量研究?！瘛瘛瘛瘛瘛竦谄哒禄蚪Y(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen171三、其他雜交技術(shù)(一)斑點(diǎn)雜交(dotblothybr（二）原位雜交

（insituhybridization）用標(biāo)記的核酸探針與組織切片或細(xì)胞中的待測(cè)核酸互補(bǔ)序列雜交，可對(duì)核酸進(jìn)行定性、定位和相對(duì)定量分析。

第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen172（二）原位雜交

（insituhybridization（三）液相雜交

(solutionhybridization)

1．核酸酶S1保護(hù)分析法

(nucleaseS1protectionassay）

單鏈DNA探針與待測(cè)RNA形成DNA/RNA雜交雙鏈，加入核酸酶S1專(zhuān)一性地降解未形成雜交體的DNA或RNA單鏈，DNA/RNA雜交雙鏈則受到保護(hù)而不被降解。第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen173（三）液相雜交

(solutionhybridizat2．RNA酶保護(hù)分析法

（RNaseprotectionassay，RPA）第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen1742．RNA酶保護(hù)分析法第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppRPA基本程序：●待測(cè)RNA的分離●體外轉(zhuǎn)錄標(biāo)記RNA探針●待測(cè)RNA與探針RNA進(jìn)行液相雜交●RNA酶消化●不同大小雜交片段凝膠電泳分離第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen175RPA基本程序：●待測(cè)RNA的分離第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的3.抑制消減雜交原理

（suppressionsubtractivehybridization，SSH）

以雜交為基礎(chǔ)，并與PCR技術(shù)結(jié)合的cDNA消減雜交方法。

應(yīng)用：差異表達(dá)新基因的篩選與克隆。第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen1763.抑制消減雜交原理

（suppressionsubtrSSH原理第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen177SSH原理第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylog

cDNAChipandMicroarray

(Ⅲ)

基因芯片和微陣列第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen178cDNAChipandMicroarray(Ⅲ)●基因芯片上的陣列是由有規(guī)則排列的cDNA或寡核苷酸等樣本所組成的?！窕虮磉_(dá)高通量分析法。第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen179●基因芯片上的陣列是由有DNA微陣列：●cDNA微陣列（cDNAmicroarray）●寡核苷酸微陣列（oligomicroarray）第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen180DNA微陣列：第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylcDNA微陣列:

在一微小的基片（硅片等）表面集成了大量分子識(shí)別探針，能夠平行分析大量基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)，因此又被稱(chēng)為cDNA芯片。第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen181cDNA微陣列:第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthy基因表達(dá)譜芯片主要技術(shù)流程：樣品熒光標(biāo)記芯片制備芯片雜交芯片洗滌和掃描掃描圖像分析102第七章基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略ppthylogen182基因表達(dá)譜芯片主要技術(shù)流程：樣品熒光標(biāo)記102第七章基因結(jié)構(gòu)核酸雜交技術(shù)和微