聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）聚合酶鏈（PCR）技術(shù)PCR反應(yīng)體系PCR技術(shù)過(guò)程及原理.聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）聚合酶鏈（PCR）技術(shù)PCR反應(yīng)體系P1聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)是一個(gè)能在試管內(nèi)模仿細(xì)胞內(nèi)核酸復(fù)制過(guò)程，也就是能在體外特異地?cái)U(kuò)增一段特定核酸序列的技術(shù).聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)是一個(gè)能在試管內(nèi)模2PCR的反應(yīng)體系參與PCR反應(yīng)的成分：模板引物

dNTPTaqDNA聚合酶Mg2+緩沖液.PCR的反應(yīng)體系參與PCR反應(yīng)的成分：模板引物dN3模板：即為要被復(fù)制的核酸片段條件：需要較高的純度.模板：即為要被復(fù)制的核酸片段.4引物：化學(xué)合成的寡核苷酸條件：1.一般長(zhǎng)度為20個(gè)核苷酸2.兩條引物的序列不能互補(bǔ)3.兩條引物之間的Tm值不能相差太多.引物：化學(xué)合成的寡核苷酸.5dNTP:4種核苷酸條件：4種核苷酸的濃度需要一致，否則容易出現(xiàn)DNA聚合酶錯(cuò)配的概率.dNTP:4種核苷酸.6TaqDNA聚合酶：是從水棲嗜熱菌中提取的一種酶，能催化DNA合成。具有5’端→3’端的外切酶活性。.TaqDNA聚合酶：是從水棲嗜熱菌中提取的一種酶，能催化D7Mg2+：是TaqDNA聚合酶的輔助因子，可以穩(wěn)定其活性.Mg2+：是TaqDNA聚合酶的輔助因子，可以穩(wěn)定其活性.8緩沖液：在擴(kuò)增過(guò)程中使PH值維持在7.2左右，使DNA聚合酶發(fā)揮最大的活性.緩沖液：在擴(kuò)增過(guò)程中使PH值維持在7.2左右，使DNA聚合酶9PCR技術(shù)基本過(guò)程變性退火延伸.PCR技術(shù)基本過(guò)程變性.10變性在熔點(diǎn)溫度的條件下（94℃左右），使雙鏈DNA結(jié)構(gòu)的氫鍵斷裂，形成兩條單鏈分子作為擴(kuò)增反應(yīng)的模板，以便與引物結(jié)合。94℃DNA雙鏈解開(kāi).變性在熔點(diǎn)溫度的條件下（94℃左右），使雙鏈DNA結(jié)構(gòu)的氫鍵11退火將反應(yīng)體系溫度將至熔點(diǎn)溫度以下（40~70℃），以便使引物與模板DNA序列互補(bǔ)，形成雜交鏈。

40~70℃

引物與DNA模板雜交

.退火將反應(yīng)體系溫度將至熔點(diǎn)溫度以下（40~70℃），以便使引12延伸將反應(yīng)體系的溫度升至72℃，此時(shí)反應(yīng)體系按照模板鏈的序列以堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則一次把dNTP加至引物的3’端，在TaqDNA聚合酶的作用下，雜交鏈不斷延伸，直至形成新的DNA雙鏈。新的DNA又可以作為下一個(gè)模板進(jìn)行擴(kuò)增，如此反復(fù)循環(huán)，可以到達(dá)數(shù)十萬(wàn)倍到百萬(wàn)倍的擴(kuò)增數(shù)

72℃4種dNTP在引物和DNA聚合酶的

的作用下延伸

.延伸將反應(yīng)體系的溫度升至72℃，此時(shí)反應(yīng)體系按照模板鏈的序列13定量PCR技術(shù)指在PCR反應(yīng)體系中加入了熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)累積實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。.定量PCR技術(shù)指在PCR反應(yīng)體系中加入了熒光基團(tuán)，利用熒光信14Taqman熒光探針：5’端熒光基團(tuán)FAM

3’端淬滅基團(tuán)

.Taqman熒光探針：.15

PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5’-3’外切酶活性將探針酶切降解，使探針上的熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)分離，使熒光基團(tuán)在激發(fā)光作用下發(fā)出熒光；每擴(kuò)增一條DNA鏈就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。16.PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5’-3’外切酶活性將探針

熒光閾值在熒光擴(kuò)增曲線指數(shù)增長(zhǎng)期設(shè)定一個(gè)熒光強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)(即PCR擴(kuò)增產(chǎn)物量的標(biāo)準(zhǔn))。閾值線實(shí)時(shí)定量PCR的兩個(gè)重要概念17.熒光閾值在熒光擴(kuò)增曲線指數(shù)增長(zhǎng)期設(shè)定一個(gè)熒光強(qiáng)度標(biāo)Ct值(cyclethreshold)的概念指PCR擴(kuò)增過(guò)程中，擴(kuò)增產(chǎn)物(熒光信號(hào))到達(dá)閾值時(shí)所經(jīng)過(guò)的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)。它與起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)成線性關(guān)系（即與起始拷貝數(shù)反比關(guān)系）C(t)值C(t)值18.12+/0.04-閾值線18.Ct值(cyclethreshold)的概念方法學(xué)評(píng)價(jià)：優(yōu)點(diǎn)：雜交效率高缺點(diǎn)：熒光淬滅難以徹底，本底較高探針的水解依賴于Taq酶的外切活性，故受酶性能和試劑質(zhì)量影響.方法學(xué)評(píng)價(jià)：.19聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）聚合酶鏈（PCR）技術(shù)PCR反應(yīng)體系PCR技術(shù)過(guò)程及原理.聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）聚合酶鏈（PCR）技術(shù)PCR反應(yīng)體系P20聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)是一個(gè)能在試管內(nèi)模仿細(xì)胞內(nèi)核酸復(fù)制過(guò)程，也就是能在體外特異地?cái)U(kuò)增一段特定核酸序列的技術(shù).聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)是一個(gè)能在試管內(nèi)模21PCR的反應(yīng)體系參與PCR反應(yīng)的成分：模板引物

dNTPTaqDNA聚合酶Mg2+緩沖液.PCR的反應(yīng)體系參與PCR反應(yīng)的成分：模板引物dN22模板：即為要被復(fù)制的核酸片段條件：需要較高的純度.模板：即為要被復(fù)制的核酸片段.23引物：化學(xué)合成的寡核苷酸條件：1.一般長(zhǎng)度為20個(gè)核苷酸2.兩條引物的序列不能互補(bǔ)3.兩條引物之間的Tm值不能相差太多.引物：化學(xué)合成的寡核苷酸.24dNTP:4種核苷酸條件：4種核苷酸的濃度需要一致，否則容易出現(xiàn)DNA聚合酶錯(cuò)配的概率.dNTP:4種核苷酸.25TaqDNA聚合酶：是從水棲嗜熱菌中提取的一種酶，能催化DNA合成。具有5’端→3’端的外切酶活性。.TaqDNA聚合酶：是從水棲嗜熱菌中提取的一種酶，能催化D26Mg2+：是TaqDNA聚合酶的輔助因子，可以穩(wěn)定其活性.Mg2+：是TaqDNA聚合酶的輔助因子，可以穩(wěn)定其活性.27緩沖液：在擴(kuò)增過(guò)程中使PH值維持在7.2左右，使DNA聚合酶發(fā)揮最大的活性.緩沖液：在擴(kuò)增過(guò)程中使PH值維持在7.2左右，使DNA聚合酶28PCR技術(shù)基本過(guò)程變性退火延伸.PCR技術(shù)基本過(guò)程變性.29變性在熔點(diǎn)溫度的條件下（94℃左右），使雙鏈DNA結(jié)構(gòu)的氫鍵斷裂，形成兩條單鏈分子作為擴(kuò)增反應(yīng)的模板，以便與引物結(jié)合。94℃DNA雙鏈解開(kāi).變性在熔點(diǎn)溫度的條件下（94℃左右），使雙鏈DNA結(jié)構(gòu)的氫鍵30退火將反應(yīng)體系溫度將至熔點(diǎn)溫度以下（40~70℃），以便使引物與模板DNA序列互補(bǔ)，形成雜交鏈。

40~70℃

引物與DNA模板雜交

.退火將反應(yīng)體系溫度將至熔點(diǎn)溫度以下（40~70℃），以便使引31延伸將反應(yīng)體系的溫度升至72℃，此時(shí)反應(yīng)體系按照模板鏈的序列以堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則一次把dNTP加至引物的3’端，在TaqDNA聚合酶的作用下，雜交鏈不斷延伸，直至形成新的DNA雙鏈。新的DNA又可以作為下一個(gè)模板進(jìn)行擴(kuò)增，如此反復(fù)循環(huán)，可以到達(dá)數(shù)十萬(wàn)倍到百萬(wàn)倍的擴(kuò)增數(shù)

72℃4種dNTP在引物和DNA聚合酶的

的作用下延伸

.延伸將反應(yīng)體系的溫度升至72℃，此時(shí)反應(yīng)體系按照模板鏈的序列32定量PCR技術(shù)指在PCR反應(yīng)體系中加入了熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)累積實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。.定量PCR技術(shù)指在PCR反應(yīng)體系中加入了熒光基團(tuán)，利用熒光信33Taqman熒光探針：5’端熒光基團(tuán)FAM

3’端淬滅基團(tuán)

.Taqman熒光探針：.34

PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5’-3’外切酶活性將探針酶切降解，使探針上的熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)分離，使熒光基團(tuán)在激發(fā)光作用下發(fā)出熒光；每擴(kuò)增一條DNA鏈就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。35.PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5’-3’外切酶活性將探針

熒光閾值在熒光擴(kuò)增曲線指數(shù)增長(zhǎng)期設(shè)定一個(gè)熒光強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)(即PCR擴(kuò)增產(chǎn)物量的標(biāo)準(zhǔn))。閾值線實(shí)時(shí)定量PCR的兩個(gè)重要概念36.熒光閾值在熒光擴(kuò)增曲線指數(shù)增長(zhǎng)期設(shè)定一個(gè)熒光強(qiáng)度標(biāo)Ct值(cyclethresh