基因工程工具酶第1頁/共34頁

第四章工具酶

工具酶

基因工程技術(shù)中能用于DNA和RNA的合成、連接、切割和修飾的各種酶。

包括：

限制酶,核酸酶.聚合酶,連接酶,激酶,磷酸酶,第2頁/共34頁

第一節(jié)限制性內(nèi)切酶

（RestrictionEndonuclease）

一.細(xì)菌的限制一修飾現(xiàn)象被發(fā)現(xiàn)

瑞士塞爾生物研究中心Arber提出限制一修飾理論：

核酸內(nèi)切酶降解細(xì)菌外源DNA,

修飾酶保護自身DNA

Arber首次從E.ColiB菌株中分離出Ⅰ型限制酶EcoB

美Hopkings大學(xué)H.Smith

從流感嗜血菌中分離Ⅱ型限制酶

Arber,Smith獲得1978年Nobel獎

第3頁/共34頁第4頁/共34頁第5頁/共34頁二.限制酶系統(tǒng)分類和命名

1985年后大量限制酶被發(fā)現(xiàn)，已從350多種微生物中發(fā)現(xiàn)2000多種限制酶，識別108種不同的特定序列

限制性內(nèi)切酶的分類

Ⅰ型:特異識別、隨機切割

Ⅱ型：特異識別、同點切割

Ⅲ型：特異識別、異地切割

通常所指的限制酶即Ⅱ類酶第6頁/共34頁

限制酶特性比較

I型

II型III型

限制與修飾由

同一酶承擔(dān) 是 否 是

酶反應(yīng)輔助因子 ATP.mg++SAMmg++ATP.mg++SAM

識別位點特性 /4-6bp回文對稱 /

切割位點 距離>1kb識別點中距3端24-26bp

舉例 EcoBBamHIEcoPL

識別位點 TGAN8TGCTGGATTCAGACC

克隆工作中用途 無 有 無

SAM:硫一腺苷甲硫氨酸第7頁/共34頁三.系統(tǒng)命名法

限制性內(nèi)切酶的命名方法

屬名 種 變種序數(shù)

1字母2字母1字母

(EcoRI)EcoRI

(HindIII)HindIII

(BamHI)BamHI第8頁/共34頁

四.一般限制酶的識別特點

1.

大多數(shù)是嚴(yán)格的識別順序，少數(shù)可變

2.

識別順序的堿基數(shù)一般為4-6bp，少數(shù)識別更長

3.

多數(shù)識別位點具有旋轉(zhuǎn)對稱性，少數(shù)的識別位

點在切割位點之外，具旋轉(zhuǎn)對稱性

第9頁/共34頁

4bpHpaⅠ CCGG

HaeⅢGGCC

5bp Ava ⅡGGWCC

EcoRⅡ CCWGG

6bp BamHⅠ G GATTC

SmaⅠ CCC GGG

11bp Bg1ⅠGCCNNNNNGGC

12bp BstXⅠ CCANNNNNNTGC

N=A,T,G,C

第10頁/共34頁五.限制酶的切割末端

5粘端 （EcoRI）

3粘端 （PstI）

平端 （SmaI）

六.限制酶產(chǎn)生的末端的連接

1.

匹配粘端:直接連接

2.平末端:萬能連接

3.不匹配粘端：S1Nuclease切去突出端

或Klenow補平

第11頁/共34頁七.識別位點與切割方式之間的關(guān)系

1.識別不同，切割不同

eg:BamHIEcoRI

-GGATCC- -AGATCT-

-CCTAGG--TCTAGA-

2.識別不同，切割產(chǎn)生末端相同(同尾酶)

eg:BamHI Bg1Ⅱ

-AGATCT-GGATCC

-TCTAGA-CCTAGG第12頁/共34頁3.識別相同，切割不同

eg:SmaI XmaI-CCCGGG- -CCCGG

-GGGCCC--GGGCCC-

4．識別相同，切割相同──同工酶同裂酶

eg:HpaⅡ MspⅠ

-CCGG- -C*CGG-

-GGCC- -GGCC-

第13頁/共34頁八.限制酶反應(yīng)的影響因素

1.

溫度：一般37C，有例外,如：SmaI25C，

BclI50C，TaqI65C

2.

緩沖液：高、中、低鹽之分(NaCl)

3.時間：1-1.5小時

4.反應(yīng)體積和甘油濃度：酶<1/10體積

5.DNA純度與構(gòu)型：第14頁/共34頁(1）純度：RNA，蛋白，氯仿，SDS，EDTA，

EB，酚，乙醇，硫酸根，DNA

(2)構(gòu)型：切超螺旋需更多的酶

例:lgDNA,EcoRI切,1U

超螺旋pUCl9,EcoRI2.5U

HindⅢ5U

SalI10U

NarI20U

第15頁/共34頁

酶單位的定義：

1U：50ul反應(yīng)體積中，1小時內(nèi)酶完全切割

1ugDNA所需要的酶量

緩沖液

NaCl 0,50,100mmol/L離子強度

Tris-HCl pH7.5-8.0

MgCl2

激活因子

DTT 保護還原性基因

第16頁/共34頁

近末端的切割：

eg:AccIGGTCGACC

切不動

CGGTCGACCG 切不動

CCGGTCGACCGG切不動

eg:EcoRIGGAATTCC CGGAATTCCG

2小時內(nèi)90%完全酶切

eg:PmeIGTTTAAAC 20小時不能切

GGTTTAAACC20小時，25%切開

GGGTTTAAACCC20小時，50%切開

AGCTTTGTTTAAACGGCGGCCGG20小時，

90%切開

第17頁/共34頁星號反應(yīng)(StarActivity)

識別專一性下降

eg:EcoRI GAATTC

EcoRI*AATT

原因：甘油濃度過高，酶濃度太大，

離子強度不適，pH不適(Ph>8.0)

存在有害試劑(>1%乙醇,DMSO,乙二醇)

陽離子變化:Mn++,Co++,Zn++,Cu++代替mg++

第18頁/共34頁酶的滅活1.加熱2.酚抽提第19頁/共34頁第20頁/共34頁第21頁/共34頁

第二節(jié)修飾酶

一.分類

細(xì)菌DNA聚合酶 *E.ColiDNA聚合酶（全酶）

*Klenow酶

T4噬菌體DNA聚合酶

T4噬菌體DNA聚合酶

*測序酶（修飾的T7pol）*TaqDNA聚合酶

*反轉(zhuǎn)錄酶末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶

依賴于DNA的RNA聚合酶

SP6噬菌體RNA聚合酶T3噬菌體RNA聚合酶

T4噬菌體RNA聚合酶

第22頁/共34頁

連接酶

E.ColiDNA連接*T4DNA連接酶

T4噬菌體RNA連接酶

激酶

T4噬菌體多核苷酸激酶

磷酸酶 *堿性磷酸酶

核酸酶

Ba131核酸酶S1核酸酶綠豆核酸酶

RNaseARNaseT1DNaseIEXoⅢ

噬菌體外切核酸酶

第23頁/共34頁

二.聚合酶

1.

E.ColiDNA聚合酶

活性:（1）53DNA聚合酶活性

（2）35核酸外切酶活性

（3）53核酸外切酶活性

主要用途：切口平移法標(biāo)記DNA

第24頁/共34頁

2.Klenow酶

枯草桿菌蛋白酶或胰蛋白酶降解

E.ColiDNA聚合酶得到的該酶的大片段

活性：（1）53聚合酶活性

（2）35外切核酸酶活性

主要用途：

(1)補平3凹端

(2)補平3凹端，末端標(biāo)記

(3)合成cDNA第二鏈

(4)體外誘變中從模板合成DNA第二鏈

第25頁/共34頁3.T4噬菌體DNA聚合酶

活性：（1）53聚合酶活性

（2）35外切核酸酶活性,比Klenow

酶強200倍

用途:3’突出端切平

4.T7噬菌體DNA聚合酶

活性：53聚合酶活性很強,

無35外切核酸酶活性

主要用途：修飾后用于測序

5.Taq酶

耐熱(75--80C)的DNA聚合酶專用于PCR第26頁/共34頁

6.逆轉(zhuǎn)錄酶：

AWV(源于鳥成髓細(xì)胞白血病病毒)，

Mo-MLV(源于Moloney鼠白血病病毒)

活性：

(1)53聚合酶活性

(2)RNaseH活性(Mo-MLV

小,cDNA得率高)

主要用途：

(1)反轉(zhuǎn)錄cDNA

(2)標(biāo)記5突出端（補平）

(3)測序第27頁/共34頁

7.末端轉(zhuǎn)移酶

作用:在DNA或RNA3’羥基上加dNTP

主要用途：(1)載體或cDNA加同聚尾(<100nt)

(2)DNA的3’OH同位素標(biāo)記

三.激酶

T4多聚核苷酸激酶

催化ATP的-磷酸基到DNA或RNA的