論文答辯歡迎各位老師指導(dǎo)抗癌活性肽對大腸癌LOVO細(xì)胞及相關(guān)凋亡基因的影響

學(xué)科專業(yè)：外科學(xué)導(dǎo)師姓名：王茂春教授指導(dǎo)教師:蘇秀蘭教授研究生姓名：白斯古楞前言大腸癌為人類常見的惡性腫瘤之一，病死率極高。在我國的發(fā)病率有大幅度提高，病死率也不斷上升，已經(jīng)位居惡性腫瘤死亡率的第4～5位[3,4]

。目前大腸癌的治療還是以手術(shù)治療為主，但即使結(jié)直腸癌病人接受了根治性手術(shù)，復(fù)發(fā)率仍較高，而再次手術(shù)的機(jī)會又很小[5]。大腸癌的高發(fā)病率與相對低存活率表明對其需要一種更有效的治療策略，需要積極探索大腸癌生物治療的新方法，以提高患者的生存質(zhì)量，延長生命，為全身治療創(chuàng)造條件。P53基因是迄今發(fā)現(xiàn)與人類腫瘤相關(guān)性最高，研究最廣泛、深入的基因之一。p53分為野生型(wild-typep53,wtp53)和突變型(mutant-typep53,mtp53）[7]

。野生型p53對細(xì)胞的分裂和增殖起負(fù)調(diào)控作用，是抑癌基因。而p53蛋白由于不穩(wěn)定，易發(fā)生突變，一旦p53發(fā)生突變，就會喪失野生型p53基因所具有的細(xì)胞周期停滯、誘導(dǎo)凋亡發(fā)生、介導(dǎo)細(xì)胞衰老、維持基因穩(wěn)定和錯配基因修飾等抑癌功能，同時獲得許多癌基因的特殊功能。

Bcl-2基因家族分為兩大類：一類是抗凋亡蛋白，另一類是促凋亡蛋白[8]。bcl-2、Bcl-xl屬于Bcl-2基因家族成員中抗凋亡蛋白一類。bcl-2基因能抑制細(xì)胞凋亡而延長細(xì)胞的壽命，但不能促進(jìn)細(xì)胞增殖，即細(xì)胞凋亡抑制基因。Bcl-xl基因是近幾年發(fā)現(xiàn)的Bcl-2家族成員的代表，為抑制凋亡的蛋白，在人體各組織中均有表達(dá)[11]。Bcl-xl功能與bcl-2相似，能與Bak蛋白一起形成異二聚體，來中和Bak蛋白的促凋亡作用，從而抑制細(xì)胞的凋亡。

實驗路線圖體外培養(yǎng)大腸癌lovo細(xì)胞分為NS、5-FU、ILP三組倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡RT--PCR方法檢測p53、Bcl-2

、Bcl-xl基因的表達(dá)得出結(jié)論統(tǒng)計學(xué)處理取3-4代的細(xì)胞作用24h實驗方法體外培養(yǎng)人體大腸癌lovo細(xì)胞株實驗分組：將大腸癌lovo細(xì)胞株常規(guī)復(fù)蘇,放入在37℃、5%CO2,飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24小時更換DMEM培養(yǎng)基一次,待細(xì)胞融合時用0.25%胰蛋白酶消化傳代,取3-4代的細(xì)胞，分別加入生理鹽水(0.5mL，對照組)、5-FU(0.5mL，陰性對照組)、抗癌活性肽(0.5mL，用藥組)用藥24h后倒置顯微鏡下觀察各組lovo細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變。收集細(xì)胞加入1ml的Trizol提取總RNA細(xì)胞總RNA鑒定：1％的瓊脂糖電泳來鑒定細(xì)胞總RNA，觀察出現(xiàn)的各個條帶及條帶亮度。

DU800紫外分光光度計測定：分別測定細(xì)胞的總RNA光密度值(OD)在260nm和280nm處的,并計算RNA的含量和純度。要求RNAOD260/OD280值在1.5-2.0之間，濃度在500ug/ml以上的符合實驗條件。RT-PCR半定量方法檢測抗癌活性肽（ACBP）對大腸癌lovo細(xì)胞p53、bcl-2、Bcl-xl基因表達(dá)的影響。RT反應(yīng)液配置試劑使用量5×PrimeScript?Buffer4μlPrimeScript?RTEnzymeMixI1μlOligodTPrimer（50μM）1μlTotalRNA根據(jù)濃度計算體積RNaseFreedH2Oupto20μl注：TotalRNA用量為1ug。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件如下:37℃15min*3（反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)）85℃5sec（反轉(zhuǎn)錄酶的失活反應(yīng)）PCR反應(yīng)液配制（15ul）

試劑使用量5×PrimeSTAR?Buffer（Mg2+plus）3.00μldNTPMixture（各2.5mM）1.20μlPrimer1（10μM）0.20μlPrimer2（10μM）0.20μlcDNA產(chǎn)物（10pg/μl）3.00μlPrimeSTAR?HSDNAPolymerase0.15μl滅菌蒸餾水upto15.00μlPCR反應(yīng)條件如下：94℃5min1Cycle94℃30sec52℃、53℃或55℃*15sec25Cycle72℃30sec72℃7min1Cycle4℃保存注：p53退火溫度為52攝氏度，bcl-2退火溫度為55攝氏度,Bcl-xl退火溫度為53攝氏度。實驗采用GAPDH片段作為內(nèi)參照。P53、bcl-2、Bcl-xl、GAPDH引物采用Oligo軟件進(jìn)行設(shè)計，由invitrogen公司合成。瓊脂糖凝膠電泳：取PCR產(chǎn)物5ul，加5xLoadingBuffer2ul，2%瓊脂糖凝膠電泳110V，100mA，25min，凝膠成像儀成像并保存結(jié)果。凝膠圖像分析軟件半定量分析測定灰度值。統(tǒng)計學(xué)分析實驗數(shù)據(jù)采用表示，組間比較采用t檢驗，兩組以上比較采用方差分析，SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。實驗結(jié)果加入生理鹽水24h后見lovo細(xì)胞生長旺盛,形態(tài)良好呈梭形或多角形，胞質(zhì)均勻透明，隨時間延長變化不大。用藥前和用藥24h后（倒置顯微鏡下，×100，x400）

生理鹽水組加入5-FU

24h后見lovo細(xì)胞數(shù)量減少，部分細(xì)胞變小、變圓、折光率減弱、核濃縮等細(xì)胞凋亡形態(tài)。用藥前和用藥24h后（倒置顯微鏡下，×100，x400）5-FU組加入ILP24h后見lovo細(xì)胞數(shù)量減少，部分細(xì)胞變小、變圓、折光率減弱、核濃縮等細(xì)胞凋亡形態(tài)。用藥前和用藥24h后（倒置顯微鏡下，×100，x400）抗癌活性肽組紫外分光光度計測定：分別測定細(xì)胞總RNA在260nm和280nm處的光密度值(OD),并計算RNA的含量和純度。數(shù)據(jù)顯示RNA純度均在OD260/OD280比值1.5-2.0之間，濃度在400-2500ug/ml之間，符合RT-PCR實驗條件。

RT-PCR檢測p53基因RNA水平表達(dá)：ACBP組與5-FU組p53基因RNA表達(dá)水平明顯低于NS組p53基因RNA表達(dá)。p53RT-PCR電泳圖

在ACBP組、5-FU組和NS組中GAPDH的表達(dá)GAPDHRT-PCR電泳圖

在ACBP組、5-FU組和NS組中GAPDH均有表達(dá)大腸癌lovo細(xì)胞p53、Bcl-2、Bcl-xl基因總RNA表達(dá)（n=3，）

組別p53基因bcl-2基因Bcl-xl基因NS組19.28±0.4012.87±0.2925.81±0.45ACBP組13.23±0.21*07.28±0.35*17.77±0.47*5-Fu組13.82±0.20**07.88±0.35**18.29±0.33**注：*P<0.01，**P<0.01VSNS組討論抗癌活性肽(anti—cancerbioactivepeptide，ACBP)來源于經(jīng)過誘導(dǎo)動物臟器，以現(xiàn)代生物技術(shù)分離、提取的一種新型抗癌生物制劑[19]。在將近十年多的研究中，目前已經(jīng)完成了對小白鼠及大白鼠進(jìn)行的急毒和長毒試驗，表明ACBP對正常的生理過程及酶的代謝基本上沒有干擾，未發(fā)現(xiàn)明顯的毒副作用。

本課題組前期研究證實：通過MTT細(xì)胞毒理實驗證實：ACBP抗癌作用的有效濃度為25ug/ml，最有效作用時間為24小時。ACBP：大量體外細(xì)胞實驗和動物體內(nèi)實驗證明，ACBP能夠抑制胃癌、大腸癌、白血病、卵巢癌、膽囊癌等多種腫瘤細(xì)胞的DNA合成，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡并使細(xì)胞向正常細(xì)胞分化，降低腫瘤病人機(jī)體血液黏稠度，提高免疫力。

本實驗選用25ug/mlACBP對大腸癌lovo細(xì)胞株作用24小時，觀察結(jié)果可見ACBP其抑癌作用機(jī)制可能與抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡有關(guān)，以進(jìn)一步探討證實ACBP的抗癌作用機(jī)理，并通過RT-PCR方法檢測p53、bcl-2、Bcl-xl基因觀察其在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)情況，為其在臨床應(yīng)用提供更為完善的理論依據(jù)。

腫瘤是因人體細(xì)胞中調(diào)控因子的平衡調(diào)控發(fā)生紊亂，導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖而誘發(fā)的。在體內(nèi)外各種致癌因素的作用下，p53基因發(fā)生缺失或突變，使其編碼的蛋白質(zhì)喪失了抑制細(xì)胞增值的作用，導(dǎo)致細(xì)胞的無限增值而引發(fā)腫瘤。變異的p53蛋白不僅喪失了阻止正常細(xì)胞發(fā)生癌變的作用，還由于突變所產(chǎn)生的異常功能(Gainoffunction)啟動一些原癌基因的過度表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化，加速腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[22.23]。bcl-2基因是原癌基因到目前發(fā)現(xiàn)的與凋亡關(guān)系最密切的基因之一。正常組織中bcl-2在自身穩(wěn)定性方面起著重要作用,一般在記憶B淋巴細(xì)胞和壽命長的干細(xì)胞群及胸腺髓質(zhì)細(xì)胞里較多，如:結(jié)腸、子宮內(nèi)膜、前列腺和皮膚中，但在上皮細(xì)胞分化末期較少出現(xiàn)。bcl-2蛋白在正常細(xì)胞中可表達(dá)于激活和發(fā)育過程，也可表達(dá)于成熟組織中，在人體多種形態(tài)的腫瘤細(xì)胞中亦可表達(dá)，走向凋亡的細(xì)胞中卻低表達(dá)或不表達(dá)[28]。Bcl-xl的表達(dá)與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程相關(guān)。該基因有2種類型:一種為Bcl-xl，與bcl-2蛋白有協(xié)同作用；另一種為Bcl-xs，與bcl-2蛋白有抑制作用[30]。Bcl-xl的功能與bcl-2比較相似，可與Bak蛋白形成異二聚體，來中和Bak基因的促凋亡作用，使抑制細(xì)胞凋亡[31]。研究表明,Bcl-xl/bax比例是決定細(xì)胞對凋亡刺激信號敏感的重要因素[33]。當(dāng)Bcl-xl表達(dá)過量時，細(xì)胞可免遭凋亡，反之，在誘導(dǎo)劑的作用下細(xì)胞容易發(fā)生凋亡。Bcl-2家族與p53的基因調(diào)控也是有著相互聯(lián)系的。一些學(xué)者認(rèn)為bcl-2能抑制p53來介導(dǎo)細(xì)胞凋亡,近年來又發(fā)現(xiàn)突變型p53是由于其在mRNA及蛋白水平下調(diào)bcl-2表達(dá)來抑制細(xì)胞凋亡，從而成為了bcl-2的調(diào)控因子。有研究發(fā)現(xiàn)，p53基因失活時,使bcl-2家族的基因調(diào)控失衡，引起凋亡抑制基因Bcl-xl在mRNA水平升高，致使靶細(xì)胞不容易誘發(fā)細(xì)胞凋亡。本試驗中，通過lovo細(xì)胞培養(yǎng)，鏡下觀察和RT-PCR檢測p53、bcl-2、Bcl-xl基因發(fā)現(xiàn)，從形態(tài)學(xué)和RNA表達(dá)兩個方面的研究提示：ACBP對大腸癌lovo細(xì)胞具有抑制生長、誘導(dǎo)凋亡作用，可能是其治療大腸癌的重要機(jī)制之一，同時也進(jìn)一步明確了ACBP的抗腫瘤療效。為抗癌活性肽對大腸癌的臨床治療提供了實驗依據(jù)，提示其具有潛在的臨床應(yīng)用前景。

結(jié)論抗癌活性肽可能通過降低細(xì)胞中p53基因的表達(dá)，下調(diào)腫瘤細(xì)胞生長與增殖能力，發(fā)揮其抗腫瘤作用?？拱┗钚噪牡目鼓[瘤作用可能與下調(diào)大腸癌lovo細(xì)胞中bcl-2、Bcl-xl基因表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1.姚國棟,蘇秀蘭,烏新林等.抗癌活性肽對荷人胃癌裸鼠細(xì)胞凋亡及BcL-2、Bax表達(dá)的影響[J].內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2010.4，32（2）103—1082.溫再和，蘇秀蘭，歐陽曉暉等.抗癌活性肽抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的研究進(jìn)展[J].內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)雜志InnerMongoliaMed,2005，37（1）,34—363.徐桂華,蘇秀蘭,中杰等.抗癌活性肽對人胃癌BGC-823細(xì)胞周期的調(diào)控[J].中華腫瘤防治雜志，2007，14（18）：1361-1364.4.龐利群，范鈺，蔣鵬程等.RNA干擾Bcl—xL基因表達(dá)對大腸癌細(xì)胞侵襲的影響[J].復(fù)旦學(xué)報，2009，36(1)，74—785.孫念峰，張建良，王國斌，抗凋亡基因Bag-1和Bcl-2在結(jié)腸癌組織的表達(dá)及相互關(guān)系的研究[J]中國現(xiàn)代普通外科進(jìn)展，2008,11（5）395—3986.趙媛媛，彭詩東，蘇秀蘭等.抗癌活性肽對鼻咽癌細(xì)胞周期的影響[J].中華耳鼻咽喉頭頸外科雜志，2006，41（8）：607-611.7.QiXie1;BilingLiang2Invivocomparisonoftransductionefficiencywithrecombinantadenovirus-mediatedp53inahumancoloncancermousemodelbydifferentdeliveryroutes[J]Chinese-GermanJournalofClinicalOncology，2008,128.Xiao-DongZhou;Jie-PingYu;Hong-GangYuExpressionofcellularFLICE-inhibitoryproteinanditsassociationwithp53mutationincoloncancer[J]WorldJournalofGastroenterology，2005-16-0199.LuisOrlandoPérez;MartinCarlosAbba;Evaluationofp53codon72polymorphisminadenocarcinomasofthecolonandrectuminLaPlata,Argentina[J]WorldJournalofGastroenterology，2006-09-01810.CaoJiang;TengLisong;ZhengShu;Constructionofp53antisenseRNAexpressionvectoranditseffectoncoloncancercells[J]

ChineseMedicalJournal，1998-04-02511.ZhenyuHea;d;ChuanbingShib；Thepotentialofcarcinoembryonicantigen,p53,Ki-67andglutathionStransferase-πasclinicohistopathologicalmarkersforcolorectalcancer[J]JournalofBiomedicalResearch，2010-01-00912.You-LiZh