模塊4獸藥殘留快速檢測獸藥和獸藥殘留的定義獸藥

指用于預(yù)防、治療、診斷動(dòng)物疾病或者有目的地調(diào)節(jié)動(dòng)物生理機(jī)能的物質(zhì)（含藥物飼料添加劑）。

獸藥殘留指給畜禽使用獸藥或添加劑后，藥物以其原形及其代謝產(chǎn)物的形式蓄積或儲(chǔ)存在動(dòng)物的細(xì)胞、組織、器官或可食性產(chǎn)品（如蛋、奶）中。

獸藥的分類抗生素、磺胺藥類、呋喃藥類、抗球蟲藥、激素藥類和驅(qū)蟲藥獸藥殘留帶來的食品安全問題Textinhere多寶魚瘦肉精獸藥殘留的快速檢測分析一、鹽酸克倫特羅檢測卡1適用范圍

此方法應(yīng)用于豬肉、內(nèi)臟和豬尿液中鹽酸克倫特羅含量的檢測。2檢測原理

本試劑運(yùn)用抗原抗體的特異反應(yīng)以及側(cè)向?qū)游龊湍z體金技術(shù)進(jìn)行樣品中克倫特羅分子的快速定性檢測。用BSA(牛血清白蛋白)偶聯(lián)的克倫特羅分子與膠體金顆粒結(jié)合后，包被在醋酸纖維素膜上；在硝酸纖維素膜上將克倫特羅抗體和BSA抗體分別包被在檢測區(qū)（T）和質(zhì)控區(qū)（C）。當(dāng)樣本加到加樣孔后，樣本中的克倫特羅分子與克倫特羅-BSA-膠體金偶聯(lián)物一起層析泳動(dòng)到檢測區(qū)競爭與克倫特羅抗體結(jié)合，剩余的克倫特羅-BSA-膠體金繼續(xù)泳動(dòng)到質(zhì)控區(qū)與抗體結(jié)合。因此，當(dāng)樣本中的克倫特羅濃度超過一定量后，膠體金偶聯(lián)物就不能與克倫特羅抗體結(jié)合，此時(shí)檢測區(qū)不出現(xiàn)紫紅色線條；當(dāng)樣本中克倫特羅濃度低于一定值或樣本中沒有克倫特羅時(shí)，膠體金偶聯(lián)物就與克倫特羅抗體結(jié)合，從而在檢測區(qū)顯示出一條紫紅色線條；而無論樣本中是否含有克倫特羅分子，質(zhì)控區(qū)都會(huì)出現(xiàn)紫紅色線條，以示檢測有效。3主要儀器

食品加工機(jī)，低速離心機(jī)，電子秤（精度0.1克），250ul單道微量移液器（移液槍）。4材料與試劑

克倫特羅膠體金法檢測卡，檢測試劑A（3%三氯乙酸溶液），檢測試劑B（0.1N氫氧化鈉溶液），pH試紙（1-14），剪刀，10ml試管（或離心管），一次性塑料吸管、一次性手套等。5操作步驟（1）從原包裝鋁箔袋中取出檢測卡，在1小時(shí)內(nèi)應(yīng)盡快地使用；（2）將肉或內(nèi)臟樣本用剪刀剪成碎條后放入食品加工機(jī)中用一字刀粉碎，秤取5g粉碎樣本置于試管中，加入5毫升檢測試劑A。蓋上蓋，搖勻，浸泡約10分鐘；（3）用離心機(jī)離心裝有浸泡液和樣本的試管2分鐘（3000rpm），用移液槍移取250μl上清液轉(zhuǎn)移入2ml檢測管中，加入極少量檢測試劑B，調(diào)整pH值至7左右；（4）將鹽酸克倫特羅檢測卡片置于干凈平坦的臺(tái)面上，用塑料吸管垂直滴加3滴無空氣樣品處理液于加樣孔內(nèi)；（5）等待紫紅色條帶的出現(xiàn)，測試結(jié)果應(yīng)在5分鐘時(shí)讀取。6結(jié)果判定陽性（+）：僅質(zhì)控區(qū)（C）出現(xiàn)一條紫紅色條帶，在測試區(qū)（T）內(nèi)無紫紅色條帶出現(xiàn)；陰性（-）：兩條紫紅色條帶出現(xiàn)。一條位于測試區(qū)（T）內(nèi)，另一條位于質(zhì)控區(qū)（C）內(nèi)；無效：質(zhì)控區(qū)（C）未出現(xiàn)紫紅色條帶，表明不正確的操作過程或檢測卡已變質(zhì)損壞，應(yīng)重新測試1次，如仍為此現(xiàn)象，應(yīng)更換檢測卡或聯(lián)系供應(yīng)廠家；陽性結(jié)果表明鹽酸克倫特羅含量在閾值以上，陰性結(jié)果表明鹽酸克倫特羅含量在閾值以下。7靈敏度

靈敏度（閾值）：根據(jù)每種檢測卡控制濃度而定，鹽酸克倫特羅有3ng/ml、5ng/ml、6ng/ml、15ng/ml、20ng/ml、30ng/ml和50ng/ml等控制規(guī)格，判斷前請(qǐng)向供應(yīng)廠家咨詢控制閾值。8注意事項(xiàng)（1）肉及內(nèi)臟中脂肪會(huì)導(dǎo)致假陽性結(jié)果，取樣時(shí)請(qǐng)?zhí)蕹庋劭梢姷闹?；?）鹽酸克倫特羅檢測卡應(yīng)在常溫下使用，不用對(duì)剛屠宰的豬肉或冷凍豬肉直接進(jìn)行檢測；克倫特羅ELISA檢測1適用范圍

此方法應(yīng)用于豬肉、內(nèi)臟、豬尿液及飼料中鹽酸克倫特羅含量的檢測。二、使用單位需自備的設(shè)備及試劑

1、設(shè)備：┅┅微孔板酶標(biāo)儀450nm/630nm┅┅振蕩器┅┅離心機(jī)┅┅天平：感量0.01g┅┅刻度移液管：10ml┅┅聚苯乙烯離心管：10ml、50ml┅┅微量移液器：單道20l～200l、100l～1000l試劑：┅┅甲醇(分析純)┅┅氫氧化鈉(分析純)┅┅濃鹽酸┅┅蒸餾水三、提供的材料與試劑

1、96孔酶標(biāo)板×1塊2、標(biāo)準(zhǔn)品×6瓶：(1ml/瓶）

0ppb,0.1ppb,0.3ppb,0.9ppb,2.7ppb,8.1ppb3、高濃度標(biāo)準(zhǔn)品：100ppb（1ml/瓶）4、克倫特羅酶標(biāo)物…………6ml5、克倫特羅抗試劑…………9ml6、底物液A液………6ml7、底物液B液………6ml8、終止液…………6ml9、濃縮洗滌液(10×)……40ml10、克倫特羅濃縮樣品稀釋液(2×)…………40ml四、溶液的配制

配液1:樣品稀釋液用去離子水將克倫特羅濃縮樣品稀釋液(2×)按1:1體積比進(jìn)行稀釋，即：1份克倫特羅濃縮樣品稀釋液(2×)+1份去離子水；用于提取樣本的稀釋，樣品稀釋液在4℃環(huán)境可保存一個(gè)月。配液2:洗滌工作液用去離子水將濃縮洗滌液(10×)按1:9體積比進(jìn)行稀釋，即：1份濃縮洗滌液(10×)+9份去離子水；用于酶標(biāo)板的洗滌，洗滌工作液在4℃環(huán)境可保存一個(gè)月。配液3:1M氫氧化鈉溶液稱取4.0g氫氧化鈉加去離子水混勻溶解定容至100ml。配液4:0.1M鹽酸溶液量取0.83ml濃鹽酸加去離子水混勻定容至100ml配液5：25%甲醇溶液將25ml無水甲醇加入到75ml去離子水中并充分混勻配液6：組織樣本提取液

80ml25%甲醇溶液加20ml0.1M鹽酸五、樣本前處理步驟

樣本處理前須知：（a）實(shí)驗(yàn)中必須使用一次性吸頭，在吸取不同的試劑時(shí)要更換吸頭。（b）實(shí)驗(yàn)之前須檢查各種實(shí)驗(yàn)器具是否潔凈，必須使用潔凈實(shí)驗(yàn)器具，以避免污染干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。（c）未處理的樣本需冷凍保存。（d）處理后的樣本可在2-8℃避光保存24h。（一）組織（帶有低脂肪的肉、肝）----稱取2.0±0.05g勻漿樣本至50ml聚苯乙烯離心管中；----加入6ml組織樣本提取液，用振蕩器振蕩搖；----4000r/min離心5min；----取1ml上清液,加入10μl1M氫氧化鈉溶液混勻（混勻后測定pH值，大約為8）；----4000r/min離心5min；----取上清液20l用于分析。（二）尿液----取20l清亮尿樣直接測定（如尿樣渾濁須經(jīng)過濾或3000g以上，15℃離心10min直至清亮），暫不使用的樣本需冷凍保存。（三）飼料前處理方法----用均質(zhì)器均質(zhì)飼料樣本；----稱取1±0.05g均質(zhì)樣本至50ml離心管中，加0.1MHCL溶液10ml，用振蕩器劇烈振蕩5min，4000r/min以上離心5min；----取1ml上清液,加入1M氫氧化鈉溶液混勻（大約40μl~70μl，混勻以后測定pH值，大約為8）；----4000r/min離心5min；---將上清液用樣品稀釋液五倍稀釋（即：1份上清液+4份稀釋后的樣品稀釋液）并充分混勻----取20l用于分析。六、檢測步驟測定前應(yīng)須知：1、使用之前將所有試劑和需用板條的溫度回升至室溫（20～25℃）。2、使用之后立即將所有試劑放回2～8℃。3、在ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性，正確的洗板操作是ELISA測定程序中的要點(diǎn)。4、在所有恒溫孵育過程中，避免光線照射，用蓋板膜封住微孔板。操作步驟：

1、將所需試劑從冷藏環(huán)境中取出，置于室溫（20～25℃）平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。2、取出需要數(shù)量的微孔板，將不用的微孔放入自封袋，保存于2～8℃。3、洗滌工作液在使用前也需回溫。4、編號(hào)：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)微孔按序編號(hào)，每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。5、加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本：加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本20l/孔到對(duì)應(yīng)的微孔中，再加入克倫特羅酶標(biāo)物50l/孔，再加入克倫特羅抗試劑80ul/孔輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25℃避光環(huán)境中反應(yīng)10min。`

6、洗板：小心揭開蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，用洗滌工作液200l/孔，充分洗滌5次，每次間隔30s，用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用未使用過的槍頭戳破）。7、顯色：加入底物液A液50l/孔，再加底物液B液50l/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25℃避光環(huán)境中反應(yīng)10min。8、測定：加入終止液50l/孔，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處（建議用雙波長450/630nm檢測，請(qǐng)?jiān)?min內(nèi)讀完數(shù)據(jù)），測定每孔OD值。(若無酶標(biāo)儀，則不加終止液用目測法可進(jìn)行判定)。七、檢測方法靈敏度、準(zhǔn)確度、精密度試劑盒靈敏度：0.1ppb樣本最低檢測限：組織樣品………0.3ppb尿液樣品………0.1ppb飼料樣品……5ppb`八、注意事項(xiàng)

1、室溫低于20℃或試劑及樣本沒有回到室溫（20～25℃）會(huì)導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。2、在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會(huì)出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。3、每加一種試劑前需將其搖勻。4、反應(yīng)終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。5、不要使用過了有效日期的試劑盒；也不要使用過了有效期的試劑盒中的任何試劑，摻雜使用過了有效期的試劑盒會(huì)引起靈敏度的降低；不要交換使用不同批號(hào)試劑盒中的試劑。

6、儲(chǔ)存條件保存試劑盒于2～8℃，不要冷凍，將不用的酶標(biāo)板微孔板放進(jìn)自封袋重新密封。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無色的發(fā)色劑對(duì)光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。7、試劑變質(zhì)的跡象發(fā)色試劑有任何顏色表明發(fā)色劑變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光