1、第一節(jié) 蛋白質(zhì)的提取和分離一、蛋白質(zhì)分離提純技術(shù)常用的蛋白質(zhì)分離提純技術(shù)包括離心技術(shù)、層析技術(shù)和電泳技術(shù)等。其中電泳技術(shù)最為快捷靈敏、簡(jiǎn)便易行。二、電泳技術(shù)分離蛋白質(zhì)的原理1蛋白質(zhì)中含有游離的氨基和羧基，是兩性電解質(zhì)，在一定pH條件下帶有電荷。2蛋白質(zhì)在電場(chǎng)中可以向與其自身所帶電荷相反的電極方向移動(dòng)。3蛋白質(zhì)所帶的電荷數(shù)越多，移動(dòng)得越快；電荷數(shù)相同時(shí)，分子量越小，移動(dòng)越快。三、結(jié)果分析不同蛋白質(zhì)的混合溶液經(jīng)過(guò)同一電場(chǎng)電泳后，會(huì)在凝膠上形成不同的帶紋，每種帶紋可能就是一種蛋白質(zhì)。四、“血清蛋白的提取和分離”活動(dòng)程序1點(diǎn)樣：取新制血清5微升、質(zhì)量濃度為0.4克/毫升的蔗糖溶液和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的

2、溴酚藍(lán)指示劑等體積混勻后，用微量加樣器吸取5 L樣品加到電泳樣品槽的膠面上。2電泳。3染色：用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05%的考馬斯亮藍(lán)R250染色液對(duì)凝膠進(jìn)行染色。4脫色：用體積分?jǐn)?shù)為7%的醋酸溶液對(duì)凝膠板進(jìn)行浸泡漂洗，至底色脫凈。5制干膠板：將已脫色的凝膠板放在保存液中浸泡3 h4 h后，放在兩層透氣的玻璃紙中間自然干燥。預(yù)習(xí)完成后，請(qǐng)把你認(rèn)為難以解決的問(wèn)題記錄在下面的表格中問(wèn)題1問(wèn)題2問(wèn)題3問(wèn)題4一、蛋白質(zhì)分離提純的方法1蛋白質(zhì)分離的基本過(guò)程破碎細(xì)胞抽提(粗制品)純化蛋白質(zhì)2破碎細(xì)胞的方法在分離與純化蛋白質(zhì)之前，必須采用適當(dāng)?shù)姆椒ㄊ沟鞍踪|(zhì)呈溶解狀態(tài)釋放出來(lái)：通常先將生物組織進(jìn)行機(jī)械破碎，再根據(jù)細(xì)胞

3、的特點(diǎn)，選擇不同的破碎細(xì)胞方法(常用的有研磨法、超聲波法、酶解法)。3抽提細(xì)胞破碎后，各種蛋白質(zhì)被釋放出來(lái)，再根據(jù)蛋白質(zhì)的不同性質(zhì)，選擇不同的溶劑進(jìn)行抽提。4純化(1)原理：純化主要是指根據(jù)蛋白質(zhì)之間以及蛋白質(zhì)與其他物質(zhì)之間在分子大小、溶解度大小、所帶電荷的多少、吸附性質(zhì)等方面存在的差異進(jìn)行的。(2)方法：透析法分子大小離心沉淀法分子大小、密度大小電泳所帶電荷多少二、“血清蛋白質(zhì)的分離”實(shí)驗(yàn)中應(yīng)注意的問(wèn)題1由于制備凝膠的丙烯酰胺和雙丙烯酰胺具有很強(qiáng)的神經(jīng)毒性，并且容易被皮膚吸收，因此操作必須在通風(fēng)櫥內(nèi)或通風(fēng)處進(jìn)行。2.將電泳凝膠片放在考馬斯亮藍(lán)R250染色液中染色30 min后，多次更換脫色液

4、至背景清晰。脫色后，可將凝膠浸于保存液中，長(zhǎng)期封裝在塑料袋內(nèi)使其不會(huì)降低染色強(qiáng)度。為保存永久性記錄，可對(duì)凝膠進(jìn)行拍照，或?qū)⒛z干燥成膠片。電泳的原理及應(yīng)用如圖為某些氨基酸在pH為6時(shí)進(jìn)行電泳的結(jié)果，請(qǐng)回答：(1)由圖示可知，帶正電荷的氨基酸是_，帶負(fù)電荷的氨基酸是_。請(qǐng)說(shuō)明理由_。(2)假設(shè)谷氨酸和賴(lài)氨酸所帶電荷數(shù)相同，它們到達(dá)兩極的速度一樣嗎？為什么？(3)若把氨基酸換成蛋白質(zhì)，會(huì)出現(xiàn)什么現(xiàn)象？【審題導(dǎo)析】解答此題應(yīng)準(zhǔn)確把握以下幾點(diǎn)：(1)氨基酸的帶電情況，(2)影響電泳速度的因素，(3)可用電泳法分離的物質(zhì)?！揪v精析】氨基酸是一種兩性電解質(zhì)，在一定pH條件下帶電荷，作為帶電粒子，氨基酸向

5、與其自身所帶電荷相反的電極運(yùn)動(dòng)，即向正極運(yùn)動(dòng)的氨基酸帶負(fù)電荷，向負(fù)極運(yùn)動(dòng)的氨基酸帶正電荷，在原點(diǎn)不動(dòng)的氨基酸，所帶正電荷和負(fù)電荷相等。蛋白質(zhì)也是一種兩性電解質(zhì)?！敬鸢浮?1)賴(lài)氨酸谷氨酸氨基酸是一種兩性電解質(zhì)，在一定pH條件下帶電荷，作為帶電粒子，在進(jìn)行電泳時(shí)氨基酸向與其自身所帶電荷相反的電極方向運(yùn)動(dòng)(2)不一樣。進(jìn)行電泳時(shí)，若氨基酸帶相同的電荷數(shù)，分子量越小，則移動(dòng)越快。兩者分子量不相等，因此，到達(dá)兩極的速度不同。(3)蛋白質(zhì)同氨基酸一樣，在一定pH條件下帶電荷，也會(huì)向與其自身所帶電荷相反的電極方向運(yùn)動(dòng)。在電場(chǎng)作用下，帶電分子會(huì)向著與其所帶電荷相反的電極方向移動(dòng)。許多重要的生物大分子，如多肽

6、、蛋白質(zhì)、核酸等都具有可解離基團(tuán)，都能夠?qū)ζ淅秒娪炯夹g(shù)分離、鑒定和提純。根據(jù)血清蛋白醋酸纖維素薄膜電泳圖譜示意圖判斷，所帶負(fù)電荷最少的球蛋白是()A1球蛋白B2球蛋白C球蛋白 D球蛋白【解析】根據(jù)電泳的原理進(jìn)行分析。帶電粒子在電場(chǎng)中向與其電性相反的電極泳動(dòng)的現(xiàn)象稱(chēng)為電泳。因此，移動(dòng)越快的，所帶負(fù)電荷就越多(點(diǎn)樣是在負(fù)極)，移動(dòng)越慢的，所帶負(fù)電荷就越少。所以球蛋白所帶負(fù)電荷最少?！敬鸢浮緿1關(guān)于電泳，下列敘述不正確的是()A蛋白質(zhì)所帶的電荷數(shù)越多，移動(dòng)得越快B蛋白質(zhì)所帶的電荷數(shù)越少，移動(dòng)得越快C電荷數(shù)相同時(shí)，分子量越大，移動(dòng)越慢D電荷數(shù)相同時(shí)，分子量越小，移動(dòng)越快【解析】電泳時(shí)蛋白質(zhì)移動(dòng)的速度

7、與所帶電荷，蛋白質(zhì)分子量大小有關(guān)，電荷越多、分子量越小、移動(dòng)越快。【答案】B2下列有關(guān)電泳現(xiàn)象的敘述，錯(cuò)誤的是()A相同蛋白質(zhì)的溶液，經(jīng)過(guò)同一個(gè)電場(chǎng)電泳后，會(huì)在支持物凝膠上形成相同的帶紋B不同蛋白質(zhì)的混合溶液，經(jīng)過(guò)同一個(gè)電場(chǎng)電泳后，在支持物凝膠上形成不同的帶紋C每一種帶紋可能就是一種蛋白質(zhì)D每一種帶紋一定不是一種蛋白質(zhì)【解析】不同蛋白質(zhì)的混合溶液，在經(jīng)過(guò)同一個(gè)電場(chǎng)電泳后，會(huì)在凝膠上形成不同的帶紋。不同的蛋白質(zhì)可以在同一帶紋中，同一種蛋白質(zhì)一定存在于同一帶紋中。【答案】D3關(guān)于血清蛋白的提取和分離過(guò)程中點(diǎn)樣的敘述，正確的是()A只用新制血清5 L點(diǎn)樣B只用質(zhì)量濃度為0.4 g/mL的蔗糖溶液點(diǎn)樣C只用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的溴酚藍(lán)指示劑點(diǎn)樣D用5