1、. 1，第五章細胞融合和單克隆抗體，2，又稱細胞融合、體細胞雜交，是指兩個以上相同或不同細胞通過膜融合形成單一細胞的過程。 一、細胞融合(一)、細胞融合的定義、三、細胞融合實際上包括多個過程：首先兩個親本細胞并排，然后膜組織局部破壞，最終形成包圍融合細胞的連續(xù)細胞膜。 融合細胞表達的特征變化有膜成分與細胞質(zhì)成分的交流及細胞內(nèi)電導率的連續(xù)性。4、細胞在融合過程中發(fā)生以下主要變化：呈致密狀態(tài)的體細胞在融合促進劑的作用下，細胞膜的性質(zhì)不發(fā)生變化，首先出現(xiàn)細胞凝集現(xiàn)象，然后一部分凝集細胞間的膜粘連，并且融合形成多核細胞培養(yǎng)過程中，多核細胞又進行核融合成為單核雜種細胞，形成單核、5、體外培養(yǎng)的細胞很少發(fā)

2、生自發(fā)融合(融合頻率約在10-410-6之間)，因此通過生物、化學或物理方法促進人為細胞融合。 (6)、(7)、顯微鏡下的細胞融合過程，(8)、融合過程中兩個細胞膜從接觸到破裂形成細胞橋的變化過程的圖解，(9)、(2)、細胞融合研究進展，Muller闡述了1838年脊椎動的腫瘤細胞Virchow是1858年在正常組織、炎癥組織及腫瘤組織中的多核細胞現(xiàn)象。 Luginbuhl在1873年觀察到天花患者的血液中也存在多核血球。 Lange于1875年首次觀察了脊椎動物(青蛙類)血液細胞融合的過程。10、Cienkawski(1876 )、Buck(1877 )、Geddes(1880 )在無脊椎動

3、物中發(fā)現(xiàn)了細胞合并現(xiàn)象。 1958年日本學者岡田(Okada )發(fā)現(xiàn)仙臺病毒具有誘發(fā)動物細胞融合的效果。 1974年華裔加拿大學者高國楠創(chuàng)立了聚乙二醇(PEG )化學融合法。 1975年Kohler和Milstein將小鼠b淋巴細胞和骨髓瘤細胞融合，產(chǎn)生了預定分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞。 80年代出現(xiàn)了電融合技術(shù)。 (11 )一些細胞融合成功的例子， 12 )植物融合細胞生長狀態(tài)對比：右瓶是地面融合細胞左瓶是宇宙微重力環(huán)境下融合的細胞，13 )用于動物細胞融合實驗的大鼠， 14，(3)，動植物細胞融合過程，15，(4)，細胞融合的意義，理論上任何細胞都通過體細胞融合過程不受雜交過程中種性隔離機

4、制的限制，為遠親種間的遺傳物質(zhì)交換提供了有效途徑。 體細胞雜交產(chǎn)生的雜種細胞中含有來自父母的核外遺傳系，在雜種分裂和增殖過程中父母的線粒體DNA也被重組，產(chǎn)生新的核外遺傳系。 淋巴細胞雜交瘤和單克隆抗體的制備。16、2、單克隆抗體技術(shù)、主要組織相容性復合體、17、(一)、單克隆抗體是什么？ Ig分子的基本結(jié)構(gòu)：由四肽鏈構(gòu)成，2條相同分子量小的輕鏈(l鏈) 2條相同分子量大的重鏈(h鏈)構(gòu)成。 l鏈和h鏈是通過二硫鍵形成一個四肽鏈的分子，是被稱為Ig分子的單體的基本結(jié)構(gòu)。18、抗體的主要類型和結(jié)構(gòu)：19、IgG由4條多肽(2條輕鏈和2條重鍵)通過二硫化物鍵和非共價鍵相連，其分子結(jié)構(gòu)像“y”型。

5、一端是抗原結(jié)合端(氨基端)可變區(qū)域(v區(qū)域)，即氨基酸的順序因免疫抗原而異，有兩個可以與同一抗原結(jié)合的部位。 另一端(羧基端)氨基酸依次排列在一定區(qū)域(c區(qū)域)，與具有Fc受體的細胞(如巨噬細胞、k細胞、肥大細胞等)結(jié)合，產(chǎn)生各不相同的效果。、20、IgG抗體結(jié)構(gòu)模型(紅色部分是CDR區(qū))、21、22、存在于抗原分子中決定抗原特異性的特殊化學基團，也被稱為表位(epitope )。 抗原決定簇的大小相當于對應的抗體的抗原結(jié)合部位，一般由58個氨基酸、單糖或核苷酸殘基組成。23、抗體與抗原的特異性結(jié)合、24、克隆定義僅針對某個抗原決定簇的抗體分子稱為單克隆抗體。 對同一抗原誘導產(chǎn)生的多個抗原決定

6、簇的抗體稱為多克隆抗體。25、單克隆抗體技術(shù)的核心是融合骨髓細胞(myeloma cell )和受特定抗源免疫刺激的b淋巴細胞(antigen stimulated B lymphoblast )獲得雜交瘤細胞(hybridoma cell )。 因此，單克隆抗體技術(shù)也被稱為雜交瘤技術(shù)(hybridoma technology )。 (二)單克隆抗體技術(shù)原理，26，(二)單克隆抗體技術(shù)原理，27，Niels K. Jerne尼爾斯杰尼斯，G. Kohler喬治JF可樂，ss杰尼是丹麥免疫學界的偉大理論家，三大理論：抗體形成的自然選擇提出了抗體多樣性發(fā)生學說、免疫系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)學說，開創(chuàng)了免

7、疫學新紀元，為建立現(xiàn)代免疫學奠定基礎(chǔ)，杰尼也被稱為“現(xiàn)代免疫學之父”。 柯勒是德國免疫學家，米爾斯坦是英國分子生物學家，兩人的杰出貢獻是利用雜交瘤技術(shù)生成單克隆抗體，闡明了單克隆抗體技術(shù)的原理。28、一些關(guān)鍵問題.29、1.HAT選擇原理(酶缺陷型)、hat系統(tǒng)是次黃苷(h )、氨基喋呤(a )和胸腺嘧啶核苷(t )的縮寫。 是根據(jù)嘌呤和嘧啶的生物合成途徑修訂的分離雜種細胞的特殊培養(yǎng)基。30、細胞內(nèi)核苷酸的生物合成有兩個途徑：一是主要途徑，葉酸及其衍生物是必不可少的，氨基喋呤可抑制二氫葉酸還原酶活性，阻斷細胞中DNA的合成。 另一種是修復途徑，該途徑需要兩種酶參與。 一種是HGPRT酶(肌苷磷

8、酸核轉(zhuǎn)移酶)，另一種是TK酶(胸苷核苷激酶)。 這些可以分別利用肌苷催化劑產(chǎn)生的肌苷酸和胸苷催化劑產(chǎn)生的脫氧胸苷合成DNA。 h、t在緊急途徑時提供外源核苷酸“前體”。 核酸合成的主要合成：核糖和磷酸合成5-磷酸核糖(R-5-P )，在磷酸核糖磷酸酶的催化下，與ATP作用生成1-焦磷酸-5-磷酸核糖(PRPP )，以后進行PRPP . 從核苷酸頭部阻斷合成IMP的途徑，細胞在HGPRT中氧化肌苷形成肌苷酸，接著轉(zhuǎn)化為AMP和GMP，即在“救濟途徑”中依賴于外來合成核苷酸。 因此，一個HGPRT或TK細胞株不能在含HAT的培養(yǎng)液中生長。 但是，如果這樣的細胞與能夠供給HGPRT和TK酶的細胞融合

9、，雜交細胞就可以在含有HAT的培養(yǎng)液中生存。33、1.hat選擇原理、34、融合細胞的親本之一在體外可長期存活的骨髓瘤細胞系，另一親本細胞若為體外增殖能力有限的正常細胞。 將長期培養(yǎng)體系突變?yōu)镠GPRT或TK酶缺陷型的細胞系，與正常細胞融合后，融合或未自融合的骨髓瘤細胞在HAT培養(yǎng)液中死亡的未融合或自融合的正常細胞在體外的生存能力有限，最終也死亡。 生存著的只有融合細胞。35、2 .骨髓瘤細胞的選擇是，如果能從脾臟分泌出這種b細胞，單獨培養(yǎng)成細胞株，得到單一種類的抗體，決定僅對一種抗原發(fā)生簇反應，其特異性極高。大量培養(yǎng)這種細胞株，可以得到質(zhì)量一定純度均勻的抗體。 這就是單克隆抗體。 但由于b細

10、胞體外增殖能力非常弱或不增殖，因此無法獲得大量的單克隆抗體。 (36 )骨髓瘤細胞采用在培養(yǎng)基上容易生長的細胞融合法，將骨髓瘤細胞的永久生長特性導入可生產(chǎn)有用抗體的b細胞，可以得到在培養(yǎng)基上永久生長的b細胞株，即雜交瘤細胞株。 得到的雜交瘤細胞具有b淋巴細胞產(chǎn)生特異性抗體的能力和腫瘤細胞在體外無限增殖的特點，能夠?qū)毎囵B(yǎng)上清液產(chǎn)生單抗。 肌氨酸轉(zhuǎn)磷酸激酶缺陷型(HGPRT-)或胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型(TK-)。 多用BALB/C小鼠的骨髓瘤細胞。 (3)細胞材料的準備(1)培養(yǎng)基：單抗培養(yǎng)基的制備中經(jīng)常使用DMEM (小鼠)和RPMI-1640 (人)兩種。 使用前添加牛胎血清和牛胎血清、抗

11、生素、谷氨酰胺等。 (2)血清：牛胎兒血清(球蛋白少)； 優(yōu)質(zhì)血清支持接種量不足20個的細胞/孔的細胞生長。 (3)抗生素：慶大鏈霉素預防細菌污染阿霉素制霉菌素預防霉菌污染小鼠體內(nèi)接種去除支原體。 (4)免疫動物，1 )動物選擇目的：希望b細胞在抗原刺激下分化增殖，增加雜交瘤細胞，特別是有利于分泌特異性抗體的雜交瘤融合細胞的頻率。 動物選擇與骨髓瘤細胞來源相同品種的動物，以BALB/c小鼠居多。41、2 .抗原和載體抗原可分為可溶性抗原(蛋白質(zhì)、核酸、多糖、多肽等)和顆粒性抗原(細胞、病毒、細菌等)。 一般的顆粒性抗原都有很強的抗原性，免疫時不加佐劑的可溶性抗原免疫需要佐劑。 初次免疫時一般用

12、完全前佐劑將抗原作為乳劑，然后強化免疫時一般用不完全前佐劑作為乳劑進行免疫。42、3 .免疫途徑不同的抗原可以不同途徑免疫，主要有腹腔注射、皮下淋巴樣器官注射、靜脈注射、脾內(nèi)免疫等，最常用的途徑是腹腔注射。43、a .腹腔注射：幾乎適用于所有抗原體，尤其適用于顆粒性抗原，腹腔注射免疫時也可以使用佐劑。 b .皮下淋巴樣器官注射：多用于可溶性抗原，多點注射有利于提高免疫效果。 c .靜脈注射：不適用于大顆粒性抗原，作為初次免疫途徑也不應該添加佐劑，以免引起血栓和過敏反應。 d .脾內(nèi)免疫：適合抗原量特別少的情況下使用，但脾內(nèi)免疫大多不產(chǎn)生明顯的血清抗體，對免疫效果的判斷有一定的影響。 (44 )

13、親本細胞的制備，1 .脾細胞的分離：一般動物需要多次增強免疫后才能得到大量分泌抗體的b細胞。 最終免疫后35天左右，取出脾臟和淋巴結(jié)細胞分離出淋巴細胞(多數(shù)為b細胞)，可以與骨髓癌細胞進行細胞融合。 分離脾細胞的方法有用脾內(nèi)注射培養(yǎng)基輕輕推出淋巴細胞的方法，也有用不銹鋼網(wǎng)擠出法分離淋巴細胞的方法。45、2 .特異性抗原富集分離的脾細胞中含有對抗原具有特異性的b細胞的比例相對較少，可以富集具有抗原特異性的b細胞。 將抗原包裹在培養(yǎng)板和其他基質(zhì)中與脾細胞結(jié)合，在這些表面具有特異性抗體的b細胞與抗原結(jié)合，使b細胞附著在培養(yǎng)板和基質(zhì)上，將未附著的細胞輕輕地洗滌除去，剩下的細胞是具有特異性抗體的b細胞，

14、用于細胞融合。46，3 .骨髓癌細胞的制備：融合親本骨髓腫瘤細胞，優(yōu)選同種骨髓腫瘤細胞或漿細胞腫瘤系統(tǒng)。 這些細胞具有發(fā)達的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，能夠產(chǎn)生大量必要的抗體，但如果不是不能產(chǎn)生自身基因編碼的抗體，雜交細胞將產(chǎn)生兩種以上的抗體，得不到單克隆抗體。腫瘤細胞系必須對選擇劑敏感，融合后可用藥物(選擇劑)去除未融合的腫瘤細胞。 經(jīng)常使用來自BALB/c鼠標的653、Sp/20、NS-1等。47，4 .細胞融合：一般用PEG誘導b淋巴細胞與骨髓瘤細胞之間的融合，操作在10分鐘內(nèi)完成骨髓瘤細胞：脾細胞為12:10。 豐富的抗原將特異性的b細胞或抗原與骨髓瘤細胞表面直接架橋，與脾細胞共溫發(fā)育，使產(chǎn)生特異性抗體的

15、b細胞與具有架橋抗原的骨髓瘤細胞特異性結(jié)合，然后進行融合，提高融合特異性。 融合后的細胞以12106個細胞/ml的濃度接種96或24孔板進行培養(yǎng)。48、促細胞融合的方法，a .病毒融合劑誘發(fā)細胞融合：中仙臺病毒(HVJ )是最早用于動物細胞融合的融合劑。 b .化學融合劑誘發(fā)細胞融合：其中聚乙二醇(PEG )最常用。 c .電融合法：利用直流脈沖誘導細胞間融合。 49、a病毒融合劑誘發(fā)細胞融合，最初采用的是皰疹病毒、麻疹病毒和腫瘤病毒等有膜病毒，而最廣泛使用的是失活的仙臺病毒病毒被膜中含有膜蛋白質(zhì)， 其表面有許多神經(jīng)氨酸酶和具有凝血活性的刺激，它們分解細胞膜上的糖蛋白，使細胞膜局部聚集在病毒周

16、圍，在高pH和Ca2條件下引起膜上蛋白分子的再分布，使膜中脂分子重新排列，打開質(zhì)膜，引起細胞融合。 50、用滅活病毒誘導的動物細胞融合過程示意圖、51、用仙臺病毒融合懸浮細胞時，將兩種親本細胞的懸浮液混合離心分離后，使細胞沉淀在滅活的仙臺病毒懸浮液中融合，沖洗掉病毒， 將融合的細胞放入選擇培養(yǎng)液中進行選擇培養(yǎng)融合貼壁細胞時，混合培養(yǎng)父母本細胞，然后將病毒直接加入混合培養(yǎng)物中，培養(yǎng)一定時間后，加入選擇培養(yǎng)液進行選擇的融合效率比浮游細胞高。52，b .化學融合劑誘發(fā)細胞融合，主要含有聚乙二醇(PEG )、聚乙烯醇、聚甘油、溶血卵磷脂、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰膽堿等，其中PEG最常用。 PEG比病毒更容

17、易制備和控制，活性穩(wěn)定，使用方便，且促進細胞融合的能力強。 PEG(polyethylene glycol，PEG )為線性多聚物，具有多種不同的分子量，細胞融合常用的PEG分子量為10004000，濃度在3050%之間。 53、PEG誘導細胞融合的機理：帶負電荷的PEG與水的氫鍵使溶液中的自由水消失，高度脫水引起細胞凝聚，形成大小不同的凝聚物。 細胞變成褶皺，大幅扭曲變形，相鄰的細胞之間緊密接觸。 54、在相鄰細胞膜緊密接觸的部位，膜內(nèi)蛋白質(zhì)粒子易位凝聚。 其次，剝離了相鄰蛋白質(zhì)的細胞膜間的脂類和脂類有可能發(fā)生反應。 接著類脂分子的紊亂和重排使接觸的細胞膜局部融合，形成小的細胞質(zhì)橋，然后細胞質(zhì)橋逐漸擴大，兩細胞最終融合。 使用聚乙二醇(PEG )法細胞融合過程、聚乙二醇(PEG