1、藥代動力學與生物利用度,華中科技大學同濟醫(yī)學院 嚴常開 博士,藥代動力學與生物利用度,藥代動力學研究中的生物樣品分析 臨床前藥代動力學研究 人體生物利用度和生物等效性 常用動力學軟件介紹,藥代動力學研究中的生物樣品分析,1.概念的統(tǒng)一 藥代動力學、生物利用度、生物等效性為三個不同且有互相聯(lián)系的概念，注意區(qū)別使用。 藥代動力學內(nèi)容包括藥物在體內(nèi)的吸收、分布、排泄、代謝過程和動態(tài)變化過程：體內(nèi)過程和速率過程 生物利用度包括絕對生物利用度和相對生物利用度 生物等效性主要是相對生物利用度的內(nèi)容,2.穩(wěn)定性 了解待測藥物和內(nèi)標物在不同pH、光照、溶劑、溫度條件下穩(wěn)定性 對于中藥或多組分制劑，應(yīng)注意他們的

2、相互作用 體液中藥物的穩(wěn)定性包括室溫、冷藏（2-8）、凍融、冷凍（-20-70）,3. 靈敏度：最低定量濃度 注意與檢測限相區(qū)別 根據(jù)藥物體內(nèi)藥物濃度確定 一般為3-5個半衰期或峰濃度的1/10-1/20 MS(pg) RF(ng)UV(g),4.選擇性 待測藥物及內(nèi)標色譜峰均要與呈基線分離 內(nèi)源性物質(zhì)、藥物的代謝物、可能的合并用藥及中藥中其他組分不干擾分析 提供對照品、空白生物樣品、空白生物樣品加對照品及用藥后的生物樣品色譜圖,5.萃取回收率 一般要求大于50% 液-液萃取 固相萃取 蛋白沉淀、超濾,6.工作曲線及線性關(guān)系 做5個點以上，一般6-7個點 最高濃度與最低濃度比值應(yīng)在50-500

3、之間 濃度寬度應(yīng)涵蓋峰濃度和最低濃度 相關(guān)系數(shù)應(yīng)大于0.99。,7.方法精密度與準確度 精密度包括日內(nèi)精密度和日間精密度 一般要求應(yīng)做5個點以上 準確度一般用相對回收率表示，應(yīng)作5個點以上 RSD應(yīng)小于10%，在LOQ附近應(yīng)小于15% 生物制品RSD應(yīng)小于15%，在LOQ附近應(yīng)小于20%,臨床前藥代動力學研究,1實驗藥品 應(yīng)注明受試藥物的名稱、批號、來源、純度、保存條件及配制方法。使用的受試藥物應(yīng)與藥效學或毒理學研究使用的一致。 對照品應(yīng)是標明含量的純品,2實驗動物 一般采用成年和健康的動物。常用動物有小鼠、大鼠、兔、豚鼠和狗等。 首選動物：應(yīng)與藥效學或毒理學研究一致。 盡量在清醒狀態(tài)下實驗，

4、動力學研究最好從同一動物多次采樣。 創(chuàng)新藥應(yīng)選用兩種或兩種以上的動物，其中一種為嚙齒類動物；另一種為非嚙齒類動物。其他類型的藥物，可選用一種動物（建議首選非嚙齒類動物，如犬或兔等）。 口服用藥不宜選用兔子等食草類動物。,3給藥途徑 所用的給藥途徑和方式，應(yīng)盡可能與臨床用藥一致。 4試驗劑量 藥代動力學研究至少應(yīng)設(shè)三個劑量組，其中一個劑量應(yīng)相當于藥效學試驗有效劑量，高劑量一般接近于最大耐受量(MTD)，以了解藥物在體內(nèi)的動力學過程是線性動力學還是非線性動力學。,5.靈敏度(sensitivity) 用最低檢測濃度或定量限（limit of quantitation , LOQ）,如 g/ml或n

5、g/ml等表示。 它是標準曲線上的最低濃度，要求能測至35個消除半衰期后或Cmax的1/101/20的血藥濃度。,6提取回收率（絕對回收率） 應(yīng)考察高、中、低三個濃度的提取回收率 一般應(yīng)高于50。,7.特異性(specificity ) 必須能證明所測的物質(zhì)為原形藥物或活性代謝物，并能排除內(nèi)源性物質(zhì)、其它代謝物和雜質(zhì)的干擾。 對于色譜法至少要提供標準品、空白樣品、外加樣品和用藥后的樣品色譜圖。,Fig 1 HPLC Chromatograms for plasma Danshensu concentration A-Standard B-Blank plasma；C- Blank plasma

6、 with Danshensu ;D-Plasma with oral of Salvia miltiorrhiza extract 1-Danshensu,8.標準曲線（standard curve） 應(yīng)分別制備藥物在不同生物樣品（如血、尿、糞、膽汁和組織勻漿等）中的標準曲線。 每條標準曲線至少包括5個濃度，并應(yīng)覆蓋整個生物樣品的濃度范圍，不得外推。 應(yīng)提供標準曲線的線性方程和相關(guān)系數(shù)（要求色譜法的r0.99，生物學方法r0.98）。,圖2. 對乙酰氨基酚血漿標準曲線,9.精密度(precision） 用日內(nèi)和日間相對標準誤差（relative standard deivation, RSD

7、%）表示方法精密度。 要求在標準曲線范圍內(nèi)選用高（接近上限）、中、低（接近LOQ）三種濃度，每一濃度至少測定5個樣品，求出各自的RSD（%）。 對g/ml級水平的RSD應(yīng)10% ，ng/ml級水平的RSD可15%。,10.準確度(accuracy） 用相對回收率(recovery）表示。 其測定與精密度類似應(yīng)在標準曲線范圍內(nèi)選用高、中、低三種濃度，每一濃度至少測定5個樣品。,11實驗設(shè)計 取樣點的設(shè)計應(yīng)兼顧到吸收相、分布相和消除相.根據(jù)研究樣品的特性，取樣點通常可安排913個點不等，即吸收相應(yīng)取23個點，達峰濃度處取23點，分布相取23點，消除相取34個點 整個采樣時間應(yīng)持續(xù)到35個半衰期或到

8、Cmax的1/101/20。 在非連續(xù)取樣的動物試驗中，每個時間點至少應(yīng)有5只動物的數(shù)據(jù);如經(jīng)同一動物多次采樣，每個時間點至少應(yīng)有3只動物的數(shù)據(jù)。 口服給藥，一般在給藥前應(yīng)禁食12小時以上。,特布他林濃度-時間曲線圖,12組織分布試驗 一般選用小鼠或大鼠，選定一個有效劑量給藥后，分別在吸收相、分布相和消除相各選一個時間點取樣測定。 測定心、肝、腎、脾、肺、腦、胃、腸、子宮或睪丸、脂肪和肌肉等重要組織中的濃度，以了解藥物在體內(nèi)的主要分布組織，特別是效應(yīng)靶器官和毒性靶器官的分布。 若某組織的藥物濃度較高，應(yīng)進一步研究消除的情況。每個時間點至少應(yīng)有5個動物的數(shù)椐。,人體生物利用度和生物等效性研究,人

9、體生物利用度（bioavailability）是反映制劑中主藥吸收進入人體體循環(huán)的相對量和速度的藥代動力學參數(shù)。 生物等效性（bioequivalancy）指一種藥物的不同制劑，在相同實驗條件下以相同劑量用于人體，其吸收程度和速度無顯著性差異。兩者概念不盡相同，但試驗方法基本一致。,1特異性 首選色譜法如HPLC、GC、GC-MS或LC-MS等方法 2標準曲線與線性范圍 必須用至少5個濃度建立標準曲線，應(yīng)使用與待測樣品相同生物介質(zhì)，線性范圍要能覆蓋全部待測濃度，不得用線性范圍外推的方法求算未知樣品的濃度。標準曲線不包括零點。,3精密度與準確度 精密度用質(zhì)控樣品的日內(nèi)和日間相對標準差（RSD）表

10、示，一般RSD應(yīng)小于15在LOQ附近RSD應(yīng)小于20。 準確度是指用特定方法測得的生物樣品濃度與真實濃度的接近程度，可用相對回收率表示，一般應(yīng)85115范圍內(nèi)，在LOQ附近應(yīng)在80120范圍內(nèi)。,表1-3 精密度試驗,日 內(nèi) 變 異 日 間 變 異,表1-2 相對回收率試驗(n=10),4最低定量限 最低定量限是標準曲線上的最低濃度點，又稱靈敏度，表示測定樣品中符合準確度和精密度要求的最低藥物濃度。 5樣品穩(wěn)定性 對含藥生物樣品在室溫、冰凍和凍融條件下以及不同存放時間進行穩(wěn)定性考察，以確定生物樣品的存放條件和時間。,6提取回收率 應(yīng)考察高、中、低三個濃度的提取回收率，其限度一般應(yīng)高于50。,7

11、質(zhì)控樣品 質(zhì)控樣品系將已知量的待測藥物加入到生物介質(zhì)中配制的樣品，用于質(zhì)量控制。一般配制高、中、低三個濃度的質(zhì)控樣品。 8質(zhì)量控制 應(yīng)在生物樣品分析方法確證完成之后開始測試未知樣品。每個未知樣品一般測定一次，必要時可進行復(fù)測。每批生物樣品測定時應(yīng)建立新的標準曲線，并隨行測定高、中、低三個濃度的質(zhì)控樣品。質(zhì)控樣品測定結(jié)果的偏差一般應(yīng)小于20。,9受試者入選條件： 一般情況應(yīng)選擇健康男性志愿者。特殊作用的藥品，則應(yīng)根據(jù)具體情況選擇適當受試志愿者，如婦科用藥，選擇健康女性志愿者；試驗藥品可能引起受試者精神或軀體依賴性反應(yīng)時，則應(yīng)選擇需要該類藥品治療的患者。,一般情況下，受試者應(yīng)具備如下條件 男性 1

12、840周歲。同一批受試者年齡不宜相差10歲以上。 體重：一般要求在標準體重10范圍內(nèi)；或體重指數(shù)BMI在2024范圍內(nèi)。 身體狀況：無心、肝、腎、消化道、神經(jīng)系統(tǒng)、精神異常及代謝異常等病史；體格檢查示血壓、心率、心電圖、呼吸狀況、肝、腎功能和血象無異常。,試驗前兩周內(nèi)未服用任何其它藥物。 簽署知情同意書。 受試者例數(shù)為1824例 絕對生物利用度試驗選用經(jīng)批準上市的相同藥物靜脈注射劑作為參比制劑。 相對生物利用度試驗選用經(jīng)批準上市的相同藥物相同劑型的主導(dǎo)產(chǎn)品作為參比制劑,對乙酰氨基酚咀嚼片生物利用度研究自愿受試者知情同意書 我自愿參加對乙酰氨基酚咀嚼片人體生物利用度和生物等效性研究。經(jīng)過華中科技

13、大學同濟醫(yī)學院臨床藥理研究所醫(yī)生對本項研究所作的充分說明，我已經(jīng)了解到，本項研究是經(jīng)國家藥品監(jiān)督管理局批準，為證實對乙酰氨基酚咀嚼片在人體吸收程度合格性而進行的工作；我已經(jīng)認識到該研究的意義、目的、藥物作用、可能出現(xiàn)的不良反應(yīng)以及有效的預(yù)防辦法。試驗期間我將按醫(yī)生要求用藥，不用任何其它藥物；按要求進餐，不吸煙、不飲酒，適度活動；按規(guī)定時間接受血樣采集和必要的觀察。臨床藥理研究所將進行必要的監(jiān)護并提供自愿受試者營養(yǎng)費，以保證工作順利進行。鑒于此，我自愿參加對乙酰氨基酚咀嚼片人體生物利用度和生物等效性研究，并按照試驗要求與醫(yī)務(wù)人員密切配合完成此項研究。 自愿受試者（簽名） 年 月 日 華中科技大學

14、同濟醫(yī)學院臨床藥理研究所 臨床藥理所醫(yī)生（簽名）_ 年 月 日,10 設(shè)計方法 一個受試制劑與一個參比制劑比較的情況下，采用兩制劑雙周期交叉試驗設(shè)計，以減少不同試驗周期和個體差異對試驗結(jié)果的影響。 受試者按隨機原則分成兩組。一組受試者先服用受試制劑，后服用參比制劑；另一組受試者先服用參比制劑，后服用受試制劑。通常應(yīng)間隔1周或2周。半衰期長的藥物，需有更長的間隔時間。,11.生物樣品采集時間點的確定 通常應(yīng)有預(yù)備試驗，為合理設(shè)計采樣點提供依據(jù)。 應(yīng)用血藥濃度測定法時，服藥前應(yīng)先取空白血樣。 一般在藥時曲線峰前部分至少取4個點，峰后部分取6個或6個以上點。總采樣點不少于11個。采樣持續(xù)到受試藥原形

15、或其活性物35個半衰期時，或持續(xù)采樣至血藥濃度為Cmax的110120以后。,12.對受試者的要求 受試者于試驗前1日和試驗期內(nèi)均勿飲用酒類和咖啡類飲料；試驗前禁食過夜10小時。于次日早晨空腹服用受試制劑或參比制劑，用150200ml溫開水送服；服藥2小時后方可再飲水，4小時后進統(tǒng)一餐。 受試者服藥后應(yīng)避免劇烈運動，亦不得長時間臥床,13.生物等效性評價 對受試制劑與參比制劑的生物等效性評價，應(yīng)從藥物吸收程度和吸收速度兩方面進行。藥代動力學參數(shù)AUC和Cmax，經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換后進行交叉試驗的方差分析與雙單側(cè)t檢驗處理。 若受試制劑AUC的90可信限落在參比制劑80125范圍內(nèi)，Cmax的90可信限

16、落在70143范圍內(nèi)，Tmax經(jīng)非參數(shù)法檢驗無差異，可以認定受試制劑與參比制劑生物等效。,常用動力學軟件介紹,1.NONLIN軟件 國外應(yīng)用最廣泛的軟件 Win Nonlin是其Windows版本，為美國Pharsight公司的產(chǎn)品 可用于幾乎所有的藥代、藥效及非房室模型的分析,藥代動力學和生物藥劑學程序包PKBP-N1 由南京軍區(qū)總醫(yī)院于1985年編制 主要功能包括： 非線性曲線擬合隔室模型并作參數(shù)估算 非線性米曼型消除動力學參數(shù)估算 非房室模型分析 給藥方案設(shè)計和預(yù)測體內(nèi)血濃變化,3P87/3P97（practical pharmacokinetic program),國家藥品評審中心組織

17、 中國藥理學會數(shù)學專業(yè)委員會編制 國內(nèi)應(yīng)用最廣 可處理各種途徑的線性和非線性藥動學模型,主要功能： 可處理不同房室數(shù)的各種線性和非線性藥動學模型的時間血濃數(shù)據(jù)，并打印藥動學參數(shù)及各種圖表 計算機自動給出可能的房室數(shù)及權(quán)重系數(shù)的計算結(jié)果 對多劑量組數(shù)據(jù)進行批處理及統(tǒng)計分析 用戶可自定義房室模型、權(quán)重系數(shù)、計算方法、收斂精度、初始值等進行研究分析 提供12種模型，其中9種屬于一級速率消除的線性房室模型，3種屬于M ichaelis-Menten消除的一房室非線性模型,MAIN MENU 1. 3p87 (New Edition) 2. Bioequivalence evaluation 3. Es

18、timation of Absorption Rate 4. Estimation of Pk parameters from urinary data 5. Exit,MAIN MENU 1. Input or Modify Data 2. Computation for Mean C-T Data or Selection of Models 3. Computation for Batch or Groups of C-T Data 4. Algorithms and Conditions Specified by User 5. Output of Computed Results 6

19、. Definition of Pharmacokinetic Models 7. Simplified Parameters Estimation System 8. Exit,MODEL: Two-compartment Model with i.v. Injection Record No. 2 Mean of Group 1 Algorithm = Marquardt Weight = 1 Compartment number = 2 Regression coefficient = .9987655 R square = .9975322 WSS = 4.953764E-02 Goo

20、dness of fit = 7.419017E-02 Maximum C(obs)-C(cal) = .1531363 Max (C-C(cal)/C) % = 11.99278 Convergent precision = 7.894796E-30 AIC = -31.06529 Run test: 4,Parameter Unit Values Standard Error A ug/ml 6.668624 2.88E-01 alpha 1/h 3.888228 3.02E-01 B ug/ml 1.162247 1.62E-01 beta 1/h 0.392228 6.58E-02 V

21、 (c) (mg)/(ug/ml) 1.276997 T 1/2 alpha h 0.178268 t 1/2 beta h 1.767202 K21 1/h 0.911100 K10 1/h 1.673882 K12 1/h 1.695475 AUC (ug/ml)*h 4.678270 CL(s) mg/h/(ug/ml) 2.137542,BIOEQUIVALENCE EVALUATION PROGRAM 1. Input PK parameters (AUC,Cmax,Tmax,. ) 2. Bioequivalence Analysis of PK parameters file i

22、nput in 1. 3. Input Concentration-Time data and create a data file 4. Estimation of Concentration-Time data file 5. Example From : Textbooks & Monographs: S-C Chow & J-P Liu 6. Exit,ANALYSIS OF BIOEQUIVALENCE 1. Input Concentration-Time data file and Estimation of Parameters 2. Display F Test and Tw

23、o two One-sided tests Procedure 3. Display Individual subject Concentration-Time data and curve 4. Printout C-T data and Estimated Parameters on Printer 5. Return to Main menu,PARAMETER:AUC(0-Tn) ANALYSIS OF VARIANCE Data without transformation - Source Sum of Squares DF Mean Squares F value P value

24、 - Inter-subjects Carry-over 554.0536 1 554.0536 7.1019 0.01578 Residuals 1404.2750 18 78.0153 5.5943 0.00032 Intra-subjects Formulation 0.0051 1 0.0051 0.0004 0.98493 Periods 5.7711 1 5.7711 0.4138 0.52814 Residuals 251.0191 18 13.9455 Total 2215.1239 39 -,Two one-side test and (1-2*alpha) confidential interval - Mean of Reference: 33.7026 Mean of Tested: 33.7266 t1: 5