1、    大鼠垂體前葉內(nèi)神經(jīng)纖維對(duì)LH分泌的興奮性調(diào)節(jié)作用(1)    】 目的：探討垂體前葉神經(jīng)纖維對(duì)黃體生成素（LH）分泌的神經(jīng)調(diào)節(jié). 方法：陰道涂片篩選出動(dòng)情間期大鼠80只，隨機(jī)等分為假手術(shù)組（SO）和去卵巢組（OVX），術(shù)后7 d處死，取出垂體前葉，用Krebs液或含河豚毒素（TTX）的Krebs液離體灌流，同時(shí)施加10 Hz或2 Hz, 時(shí)間為10 min或2 min的電場刺激（EFS）. 從施加EFS前10 min開始，每10 min收集灌流液1次，連續(xù)收集130 min，放免法檢測LH濃度. 結(jié)果：Kr

2、ebs液單純灌流時(shí)，SO組的LH平均濃度為(4.8±0.5) IU/L，OVX組LH平均濃度為(7.1±1.3) IU/L，兩組間存在顯著差異（P<0.05）. 10 Hz持續(xù)10 min的EFS后10 min內(nèi)兩組的LH濃度較基礎(chǔ)水平有顯著增高. SO組由(4.9±0.1) IU/L升高至(15.7±0.8) IU/L; OVX組由(7.5±4.7) IU/L升高至(20.0±1.4) IU/L（P<0.05）. 而改用含TTX的Krebs液灌流后，同參數(shù)的EFS后10 min內(nèi)LH濃度在SO組和OVX組分別為(5.4&

3、#177;0.5) IU/L和(7.7±0.9) IU/L，提示其分泌被顯著抑制. 其余各參數(shù)的EFS對(duì)LH分泌均無明顯影響. 結(jié)論：垂體前葉內(nèi)神經(jīng)纖維可能對(duì)LH的分泌存在直接的調(diào)節(jié).    【關(guān)鍵詞】 電場刺激；黃體生成素；垂體前葉；神經(jīng)纖維；卵巢切除術(shù)；河豚毒素；大鼠    黃體生成素（luteinizinghormone, LH）是由垂體前葉（anterior pituitary, AP）促性腺激素細(xì)胞合成和分泌的一種激素，分泌調(diào)控傳統(tǒng)上認(rèn)為是下丘腦通過體液途徑實(shí)現(xiàn)的. 近年來研究表明，哺乳類動(dòng)物A

4、P內(nèi)存在P物質(zhì)（substance P, SP）、降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin generelated peptide, CGRP)等多種肽能神經(jīng)纖維1-2，且SP免疫反應(yīng)陽性神經(jīng)纖維可與促性腺激素細(xì)胞形成突觸3，但這些纖維對(duì)LH的分泌是否有直接調(diào)節(jié)，目前的研究報(bào)道較少. 本實(shí)驗(yàn)采用離體灌流大鼠AP組織薄片結(jié)合電場刺激（electrical field stimulation, EFS）的方法4-5，通過觀察灌流液中LH的分泌變化，探討AP神經(jīng)纖維對(duì)LH分泌是否有直接調(diào)控作用，為垂體前葉激素分泌的神經(jīng)體液雙重調(diào)節(jié)假說提供實(shí)驗(yàn)依據(jù).    1材料

5、和方法    1.1材料成年雌性SD大鼠80只，體質(zhì)量200220 g，由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供. 125I標(biāo)記LH的放射免疫檢測試劑盒為天津協(xié)和生物有限公司產(chǎn)品；河豚毒素(tetrodotoxin, TTX)為原中科院上海生理所產(chǎn)品；SEN301型電刺激儀、監(jiān)視器為日本Nikon Kohden公司產(chǎn)品；FJ2003全自動(dòng)晶體閃爍計(jì)數(shù)儀為西安國營262廠產(chǎn)品.    1.2方法    1.2.1電場刺激和分組每日作陰道涂片確定其動(dòng)情周期，待動(dòng)情周期穩(wěn)定后，選取動(dòng)情間期大

6、鼠80只隨機(jī)等分到假手術(shù)(sham operation, SO)組和去卵巢(ovariectomy, OVX)組. 麻醉下，手術(shù)暴露SO組大鼠雙側(cè)卵巢后即縫合腹腔；OVX組大鼠進(jìn)行雙側(cè)卵巢切除術(shù). 術(shù)后7 d處死動(dòng)物，取出AP，行電場刺激實(shí)驗(yàn). 根據(jù)電場刺激頻率和強(qiáng)度的不同，SO組40只大鼠隨機(jī)又分為10個(gè)亞組（分別稱為SA1SA5組，SB1SB5組），每組4只. SA1SA5組均用Krebs液灌流. 其中SA1組不施加電場刺激；SA2組用10 Hz電場刺激10 min，SA3組用10 Hz電場刺激2 min；SA4組用2 Hz電場刺激10 min；SA5組用2 Hz電場刺激2 min. SB

7、1SB5組用含1 mol/L TTX的Krebs液灌流，刺激條件與對(duì)應(yīng)的A1A5組分別相同. OVX組分組同SO組，分別稱為OA1OA5組和OB1OB5組.    1.2.2組織薄片制備和灌流大鼠斷頭，迅速取出AP. 用自制的多頭刀架將AP沿矢狀軸切成厚度為0.8 mm的組織薄片，迅速移至灌流小室內(nèi)，用氧飽和的(含950 mL/L O2和50 mL/L CO2) Krebs液（KrebsRinger bicarbonateBSAbuffer, KRBGA）或含1 mol/L TTX的Krebs液灌流，流速為1×10-4 L/min. Krebs

8、液的成分(mmol/L): NaCl 119; KCl 4.7; CaCl2 2.5; KH2PO4 1.2; MgSO4 1.2; NaHCO3 25; Glucose 11;另含牛血清白蛋白1 g/L和桿菌肽40 mg/L. 平衡灌流50 min后開始收集灌流液，每10 min收集灌流液1次，連續(xù)收集130 min，其中第1次灌流液收集后的10 min期間施加EFS，繼續(xù)收集灌流液100 min后改用含高鉀的Krebs液(mmol/L: NaCl 64.9; KCl 58.8; 余成分同前)灌流10 min，以高鉀誘發(fā)垂體前葉促性腺激素細(xì)胞LH的功能性釋放，借以判定所測定的垂體細(xì)胞的功能狀

9、態(tài)，各組各時(shí)段收集的樣品置-20凍存待測.            【關(guān)鍵詞】電場刺激；黃體生成素；垂體前葉；神經(jīng)纖維；卵巢切除術(shù)；河豚毒素；大鼠Excitatory regulative effect o         本篇論文是由3COME文檔頻道的網(wǎng)友為您在網(wǎng)絡(luò)上收集整理餅投稿至本站的，論文版權(quán)屬原作者，請(qǐng)不用于商業(yè)用途或者抄襲，僅供參考學(xué)習(xí)之用，否者后果自負(fù)，如果此文侵犯您的合法權(quán)益，請(qǐng)聯(lián)

10、系我們。    1.2.3LH測定按125I標(biāo)記LH的放射免疫檢測試劑盒說明書進(jìn)行灌流液中LH濃度的測定. LH濃度以IU/L表示.    統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：數(shù)據(jù)用x±s表示，采用SPSS 10.0軟件進(jìn)行重復(fù)測量設(shè)計(jì)的方差分析，P0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.    2結(jié)果     SA1組：未施加EFS，僅Krebs液單純灌流，整個(gè)灌注過程LH一直處于較低的穩(wěn)定狀態(tài)，在4.35.5 IU/L之間浮動(dòng)，LH平均濃度為(4.8

11、77;0.5) IU/L； SB1組：用含TTX的Krebs液灌流對(duì)LH基礎(chǔ)分泌水平無影響，LH平均濃度為(5.0±0.6) IU/L；SA2組,SB2組：10 Hz，10 min的EFS后10 min LH分泌顯著升高（SA2組），這種作用可被TTX阻斷（SB2組）；SA3SA5組,SB3SB5組的LH濃度在其相應(yīng)參數(shù)EFS后與基礎(chǔ)水平相比均無顯著性變化. OA1組：未施加EFS，LH濃度在5.010.4 IU/L之間波動(dòng)，平均分泌水平(7.1±1.3) IU/L，較SA1組相比有明顯增高（P<0.05）；OA2組,OB2組：10 Hz，10 min的EFS可引發(fā)L

12、H分泌的短暫升高（OA2組），這種作用可被TTX阻斷（OB2組）； OA3OA5組,OB3OB5組LH濃度在其相應(yīng)參數(shù)EFS后與基礎(chǔ)水平相比均無顯著性變化. SA2，SB2，OA2和OB2組的LH值變化曲線見圖1.    3討論    LH是AP分泌的一種重的生殖激素，傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為其分泌受到下丘腦促性腺激素釋放激素脈沖分泌和性腺甾體激素的負(fù)反饋雙重調(diào)節(jié)6. 我們研究組以前的工作發(fā)現(xiàn)，卵巢切除可增加AP中神經(jīng)纖維的數(shù)量及其與促性腺激素細(xì)胞形成的突觸的比例3,7. 在本實(shí)驗(yàn)中為了更加容易監(jiān)測到EFS對(duì)離體垂體LH分泌的

13、影響，我們采用了卵巢切除術(shù)后7 d大鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物. 與假手術(shù)組的大鼠相比，無論單純灌流還是施加各種參數(shù)的EFS，OVX組灌流液中LH的濃度均明顯高于SO組，提示卵巢切除可使垂體前葉LH分泌增加.    本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Krebs液灌流的AP組織薄片在10 Hz，10 min的EFS下LH的分泌明顯增加，且該效應(yīng)在用含1 mol/L TTX的Krebs液灌流時(shí)被明顯抑制，因而我們認(rèn)為這種現(xiàn)象主是電場刺激興奮了垂體前葉的神經(jīng)纖維所致. 盡管垂體腺細(xì)胞上存在TTX敏感型Na 通道8，但它并不與激素的基礎(chǔ)分泌有關(guān)，促性腺激素（gonadotropin, GTH）分

14、泌主是由持久型電壓門控Ca2 通道引起的，離體培養(yǎng)的促性腺激素細(xì)胞受到刺激興奮后加入TTX并不能抑制GTH的分泌9. 因此，我們認(rèn)為EFS主是興奮了神經(jīng)纖維而介導(dǎo)了LH分泌效應(yīng)，提示垂體前葉內(nèi)神經(jīng)纖維對(duì)LH存在直接神經(jīng)調(diào)節(jié).    以前我們?cè)鴪?bào)道，AP神經(jīng)纖維對(duì)ACTH的分泌存在神經(jīng)調(diào)節(jié)4-5，本實(shí)驗(yàn)中我們進(jìn)一步觀察到AP神經(jīng)纖維對(duì)LH的分泌也存在直接的神經(jīng)調(diào)節(jié)，引起LH分泌的刺激參數(shù)與誘發(fā)ACTH分泌的刺激參數(shù)不同. LH只有在10 Hz，10 min的EFS下才出現(xiàn)了分泌水平的改變，而10 Hz，2 min和2 Hz，10 min或2 min的EFS

15、刺激卻沒有任何效應(yīng)，考慮其原因可能是AP內(nèi)腺細(xì)胞膜上遞質(zhì)受體的種類、數(shù)量及分布的不同而引起的. 10 Hz高頻刺激可引起AP神經(jīng)纖維末梢釋放經(jīng)典遞質(zhì)和多肽類遞質(zhì)，而2 Hz低頻刺激引起經(jīng)典類遞質(zhì)的釋放10. LH對(duì)低頻刺激的不敏感的現(xiàn)象提示我們，AP神經(jīng)纖維調(diào)控LH分泌可能是通過促性腺激素細(xì)胞膜上的多肽類受體介導(dǎo)的. 另外，本實(shí)驗(yàn)還觀察到LH分泌對(duì)10 Hz刺激10 min與同頻率刺激2 min表現(xiàn)出不同的反應(yīng)性，說明LH的分泌不僅依賴于刺激頻率，還依賴于刺激的時(shí)程，這可能與不同刺激方式釋放出遞質(zhì)的量有關(guān)系. 該實(shí)驗(yàn)為AP受神經(jīng)直接調(diào)控提供了初步的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也使我們對(duì)LH的分泌模式增加了一種新

16、的認(rèn)識(shí). 但是與體液途徑相比，垂體前葉內(nèi)神經(jīng)纖維的“快速調(diào)節(jié)”在激素分泌調(diào)節(jié)中所占的比重及地位尚不明確，還有待我們進(jìn)一步深入研究.    【參考文獻(xiàn)】    1 Ju G, Liu SJ, Ma D. Calcitonin generelated peptide and Substance Plikeimmunoreactive innervation of the anterior pituitary in the rat J. Neuroscience, 1993, 54: 981-989. 

17、0;  2 孟繁東，鞠躬. 大鼠垂體前葉GAP43樣陽性神經(jīng)纖維與腺細(xì)胞之間的關(guān)系J. 第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào), 2004, 25(10): 887-889.    3 Liu YY, Morris JF, Ju G. Synaptic relationship of Substance Plike immunoreactive nerve fibers with gland cells of the anterior pituitary in the rat J. Cell Tissue Res, 1996, 285: 227-234.&

18、#160;   4 Gao LZ, Ju G. Dual excitatory and inhibitory effects of stimulation of intrinsic innervation of the anterior pituitary on adrenocorticotropic hormone release in the rat J. J Neuroendocrinol, 2004, 16: 5-9.    5 Gao LZ, Zhang WH, Ju G. Suppression of adrenocorticotricotropic hormone release by stimulation of the nerve fibres in the anterior pituitary J. J Neuroendocrinol, 2000, 12: 753-757.    6 楊增明，孫青原，夏國良，等. 生殖生物學(xué)M. 北京：科學(xué)出版社，2004：325-360.    7 魏曉燕，劉津平，賈軼，等. 卵巢切除后大鼠垂體前葉生長相關(guān)蛋白43免疫反應(yīng)性及其與促性腺激素細(xì)胞的關(guān)系J. 中國神經(jīng)科學(xué)雜志,