1、膠質(zhì)瘤分子病因研究【摘要】隨著高通量分子生物技術(shù)的完善，尋找膠質(zhì)瘤確切的分子病因成為可能。在基因工程鼠模型制作過(guò)程中發(fā)現(xiàn)了多個(gè)癌基因和抑癌基因的敲除、轉(zhuǎn)入或轉(zhuǎn)染后發(fā)生了類似人類的惡性浸潤(rùn)性膠質(zhì)瘤，但所謂的“癌前期變的責(zé)任分子尚未明確。膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的研究成功和迅速開展為之開拓了新途徑。膠質(zhì)瘤干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞和正常膠質(zhì)細(xì)胞三者間能否轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)化條件的探究是當(dāng)今研究的膠質(zhì)瘤分子病因的新策略。在神經(jīng)干細(xì)胞向膠質(zhì)瘤干細(xì)胞演變過(guò)程中尋找上述的責(zé)任分子是研究者看好的新途徑?！娟P(guān)鍵詞】膠質(zhì)瘤膠質(zhì)瘤干細(xì)胞神經(jīng)干細(xì)胞分子病因leularEtilgyfGliaAbstrat：ithprgressntehniques

2、fhigh?鄄thrughputleularbilgialdetetin,itispssiblentpursuethepreiseleularetilgyfglia.alignantinvasivegliaslikehuanunterparthavebeenbtainedingenetiengineeringiedelshenknkut,knk?鄄inrtransfetedithseveralngenesrtursuppressrgenes.Hever,definiteleularpathaysrespnsiblefr“pre?鄄anerhangeKeyrds：glia;gliasteells

3、;neuralsteells;leularetilgy雄性原核中，然后轉(zhuǎn)入假孕鼠輸卵管，試圖制作基因工程鼠腫瘤模型，遺憾的是在仔鼠中未發(fā)生膠質(zhì)瘤。直至1995年，AndreDanks用星形細(xì)胞特有的骨架蛋白GFAP基因和抑制p53抑癌基因蛋白活性的SV40Tag基因結(jié)合導(dǎo)入受精卵雄性原核制作成功的基因工程鼠，產(chǎn)生了低惡性星形細(xì)胞瘤，但SV40是病毒基因，并不是人源基因。進(jìn)入21世紀(jì)，研究者用多種基因修飾的方法制作膠質(zhì)瘤發(fā)生的分子模型獲得成功，提示膠質(zhì)瘤分子病因研究進(jìn)入了新時(shí)代。1基因工程鼠與膠質(zhì)瘤分子病因近幾年，采用基因轉(zhuǎn)染、基因敲除等方法已經(jīng)建立了一批膠質(zhì)瘤基因工程鼠。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Ras、V?

4、鄄Sr、Rb和SV40與星形細(xì)胞瘤發(fā)生有關(guān)：把一個(gè)含有GFAP啟動(dòng)子及V12H?鄄Ras的基因轉(zhuǎn)入鼠胚胎細(xì)胞后能開展成星形細(xì)胞瘤2。也有用GFAP調(diào)控元件控制下的V?鄄Sr激酶制作而成3。還有通過(guò)Rb家族蛋白質(zhì)特定性滅活制作的4。轉(zhuǎn)染的SV40T抗原能抑制p53也能產(chǎn)生星形細(xì)胞瘤。PDGFR，RAS/tv?鄄a，INK4a?鄄Arf與少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤發(fā)生有關(guān)：采用RAS/tv?鄄a轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)，假如轉(zhuǎn)到的是GFAP高表達(dá)的成熟細(xì)胞中，約40%的鼠產(chǎn)生少突細(xì)胞瘤或混合型少突細(xì)胞瘤；假設(shè)把tv?鄄a轉(zhuǎn)基因鼠與缺少INK4a?鄄Arf基因位點(diǎn)的次級(jí)鼠雜交繁殖那么能增加間變性少突膠質(zhì)瘤的發(fā)生率。也有在超聲

5、成像指引下直接把荷有PDGF?鄄B基因的LV載體注入胚胎鼠腦內(nèi)，產(chǎn)生多種類型腫瘤，其中少數(shù)的是少突細(xì)胞瘤，多數(shù)的是膠母細(xì)胞瘤5。Ras、Akt、Nf1、is與多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤發(fā)生有關(guān)：把Ras和Akt結(jié)合轉(zhuǎn)入Ntv?鄄a轉(zhuǎn)基因小鼠可誘導(dǎo)產(chǎn)生膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，而僅把其中之一注入就沒(méi)有見(jiàn)到腫瘤形成6，假設(shè)兩者同時(shí)轉(zhuǎn)入帶有失活等位基因INK4a?鄄ARF的Ntv?鄄a小鼠那么能加速膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的形成。也有用p53敲除鼠和Nf1以及is雜合子敲除鼠交配而產(chǎn)生Nf1和p53雙沉默鼠模型7，可產(chǎn)生星形細(xì)胞瘤或膠質(zhì)母細(xì)胞瘤。Pth、SHH、p53和Rb與髓母細(xì)胞瘤發(fā)生有關(guān)：用Pth敲除方法制作的Pth+/?鄄

6、鼠在12個(gè)月內(nèi)形成髓母細(xì)胞瘤的發(fā)生率為14%19%8，假設(shè)再與p53缺陷鼠交配，其后代的髓母細(xì)胞瘤發(fā)生率上升到95%9。也有用帶有逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的SHH在超聲成像系統(tǒng)指引下直接注入胎鼠小腦制作髓母細(xì)胞瘤模型獲得高發(fā)生率者10。結(jié)合敲除小腦外顆粒細(xì)胞層中的神經(jīng)祖細(xì)胞的p53和Rb也能產(chǎn)生髓母細(xì)胞瘤11。2從膠質(zhì)瘤起源細(xì)胞中找分子病因研究膠質(zhì)瘤的分子病因，其起源細(xì)胞存在爭(zhēng)論?；貞洑v史，早在上個(gè)世紀(jì)20年代Bailey和ushing提出瘤的起源細(xì)胞來(lái)自其同名的正常細(xì)胞，理由是在顯微鏡下觀察到星形細(xì)胞瘤的形態(tài)象星形細(xì)胞，少突膠質(zhì)瘤的細(xì)胞形態(tài)象少突膠質(zhì)細(xì)胞等。當(dāng)這些腫瘤變得更加惡性時(shí)，細(xì)胞形態(tài)象其低分化

7、的前體細(xì)胞，因此把惡性星形細(xì)胞瘤稱為星形母細(xì)胞瘤。到了上個(gè)世紀(jì)下半葉，通過(guò)電子顯微鏡觀察和免疫組化GFAP證實(shí)，星形細(xì)胞瘤由表達(dá)星形細(xì)胞分化特征的細(xì)胞組成。我們?cè)谙惹暗哪z質(zhì)瘤細(xì)胞誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)中12，也見(jiàn)到了瘤細(xì)胞由雙極梭形向多極星形方向分化，成熟星形細(xì)胞特有的標(biāo)記蛋白GFAP的表達(dá)量也隨之增加。鑒于此，膠質(zhì)瘤是由正常的膠質(zhì)細(xì)胞在特定的情況下轉(zhuǎn)化而來(lái)的學(xué)說(shuō)，幾乎沒(méi)有人疑心過(guò)。其實(shí)Bailey和ushing關(guān)于膠質(zhì)瘤起源細(xì)胞學(xué)說(shuō)，至少對(duì)神經(jīng)節(jié)膠質(zhì)細(xì)胞瘤和少突星形膠質(zhì)瘤的細(xì)胞起源問(wèn)題不能圓滿解釋。因?yàn)榍罢咄瑫r(shí)存在瘤性神經(jīng)元和瘤性星形細(xì)胞，后者同時(shí)存在少突和星形兩種瘤細(xì)胞。假設(shè)用起源于其前體細(xì)胞或干細(xì)

8、胞來(lái)解釋，在理論上是成立的13，因?yàn)樯窠?jīng)干細(xì)胞可分化成神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞，膠質(zhì)祖細(xì)胞可分化成少突細(xì)胞和星形細(xì)胞。神經(jīng)干細(xì)胞具有遷移性和多向分化特征，當(dāng)受到“致癌性刺激時(shí)，發(fā)生的分化既有正常細(xì)胞，又有瘤性細(xì)胞多向分化特征。這種理論推導(dǎo)，在后來(lái)的實(shí)驗(yàn)中得到了部分證實(shí)，如Hlland6，轉(zhuǎn)導(dǎo)Ras、Akt、PDGF和Ink4a-等基因于膠質(zhì)祖細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)中，從獲得的基因工程鼠腫瘤標(biāo)本來(lái)看，無(wú)論在形態(tài)和浸潤(rùn)性等方面都非常象人的膠質(zhì)瘤，而不象既往移植于裸小鼠，缺乏浸潤(rùn)特征的可移植性膠質(zhì)瘤。3從腫瘤干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞和正常膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化關(guān)系中尋找膠質(zhì)瘤的分子病因?qū)σ粋€(gè)膠質(zhì)瘤患者來(lái)說(shuō)，機(jī)體中存在膠質(zhì)瘤干細(xì)胞gli

9、asterells、正常膠質(zhì)細(xì)胞nralgliyte和神經(jīng)干細(xì)胞neuralsteells，它們之間存在何種關(guān)系見(jiàn)圖1，這是筆者在兩年前提出的假設(shè)14，根據(jù)最新進(jìn)展加以修改成示意圖。它們之間在特定條件下是可以轉(zhuǎn)化的，其中實(shí)線箭頭之間的轉(zhuǎn)化已經(jīng)得到公認(rèn)，虛線箭頭之間的轉(zhuǎn)化已有實(shí)驗(yàn)得到部分證實(shí)，空心箭頭之間尚未有人提出它們之間的相關(guān)性。從將來(lái)的分子程度研究前景來(lái)看，預(yù)計(jì)無(wú)論是順時(shí)針還是逆時(shí)針?lè)较蚓锌赡馨l(fā)生轉(zhuǎn)化，有的僅是其轉(zhuǎn)化的分子條件不具備，所以看不到轉(zhuǎn)化。例如神經(jīng)干細(xì)胞向正常膠質(zhì)細(xì)胞分化，在胚胎發(fā)育的研究中早已得到證實(shí)。而正常膠質(zhì)細(xì)胞返回到神經(jīng)干細(xì)胞，既往認(rèn)為是不可能的，而如今已有實(shí)驗(yàn)證實(shí)，神

10、經(jīng)干細(xì)胞向正常膠質(zhì)細(xì)胞分化的過(guò)程中，至少有部分階段是可逆的15，16。又如，腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)分化的實(shí)驗(yàn)，可以將膠質(zhì)瘤細(xì)胞返回至正常膠質(zhì)細(xì)胞也有部分實(shí)驗(yàn)得到證實(shí)。我們?cè)缦鹊膶?shí)驗(yàn)也看到了這種轉(zhuǎn)化現(xiàn)象17。再往前追溯，上個(gè)世紀(jì)60年代，Piere在鼠畸胎癌的實(shí)驗(yàn)中18，發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞可以自發(fā)地向良性甚至是正常細(xì)胞方向分化。在臨床上，偶爾也能見(jiàn)到經(jīng)病理證實(shí)的癌腫出現(xiàn)自發(fā)消退。神經(jīng)干細(xì)胞向膠質(zhì)瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化的可能性雖然尚無(wú)直接證據(jù)，但作為一個(gè)推理已經(jīng)受到了神經(jīng)腫瘤學(xué)界的高度關(guān)注6，14，特別是膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的研究迅速進(jìn)展19，已有充分證據(jù)證明，膠質(zhì)瘤組織中存在類似于腦組織存在的具有多向分化潛能干細(xì)胞20，膠質(zhì)瘤干細(xì)胞

11、是直接生成膠質(zhì)瘤的細(xì)胞，由于它們之間存在許多相似性，已有人推測(cè)膠質(zhì)瘤細(xì)胞由神經(jīng)干細(xì)胞轉(zhuǎn)化而來(lái)。然而膠質(zhì)瘤細(xì)胞向神經(jīng)干細(xì)胞轉(zhuǎn)化，尚未見(jiàn)報(bào)道，但有許多跡象說(shuō)明，兩者之間存在著目前還無(wú)法說(shuō)清楚的淵源關(guān)系。例如我們正研究的SHG?鄄44人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中存在著為數(shù)不多的D133+和為數(shù)不少的Nestin+細(xì)胞，這與我們先前研究的人胚胎神經(jīng)干細(xì)胞表達(dá)的D133和Nestin蛋白的情況非常相似21，22。我們還在神經(jīng)節(jié)細(xì)胞膠質(zhì)瘤惡化和神經(jīng)干細(xì)胞分化過(guò)程中用RT?鄄PR方法檢測(cè)到了共同調(diào)控分化基因D223。還有曾一度作為神經(jīng)干細(xì)胞的標(biāo)志物Nestin在許多膠質(zhì)瘤細(xì)胞系和實(shí)體瘤組織中表達(dá)24，都能說(shuō)明這一點(diǎn)。不

12、僅如此，令人感興趣的是腦內(nèi)神經(jīng)干細(xì)胞還有向膠質(zhì)瘤遷移的特征，如Abdy等25將神經(jīng)干細(xì)胞注入荷瘤鼠腫瘤部分，它最終能遍布整個(gè)腫瘤，并隨腫瘤細(xì)胞一起向其它部位遷移；假如注入腦內(nèi)遠(yuǎn)離腫瘤的部位，神經(jīng)干細(xì)胞還會(huì)穿過(guò)正常腦組織向腫瘤遷移。因此，我們不妨作個(gè)推測(cè)，臨床膠質(zhì)瘤標(biāo)本中有可能同時(shí)存在神經(jīng)干細(xì)胞和腫瘤干細(xì)胞，至少是在腫瘤發(fā)生的早期是這樣。正如前述，神經(jīng)干細(xì)胞和腫瘤干細(xì)胞共同表達(dá)D133和Nestin蛋白，它們之間的鑒別和是否可以轉(zhuǎn)化，有待進(jìn)一步研究證實(shí)。當(dāng)然這種研究的難度大，風(fēng)險(xiǎn)性也高，但客觀條件日趨成熟，如人類基因組草圖已經(jīng)完成，GeneBank中收錄的核酸序列高達(dá)1700多萬(wàn)條，Siss?鄄

13、pr蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中收錄蛋白質(zhì)序列也有11萬(wàn)多條可供檢索26。隨著高通量基因檢測(cè)手段不斷完善27，集分子生物學(xué)、數(shù)學(xué)和計(jì)算機(jī)科學(xué)為一體的生物信息學(xué)的產(chǎn)生和應(yīng)用28，即從高科技的開展速度來(lái)看，在不久的將來(lái)，從分子程度有可能說(shuō)明如圖1所示的神經(jīng)干細(xì)胞、正常膠質(zhì)細(xì)胞、膠質(zhì)瘤細(xì)胞三者之間的關(guān)系，膠質(zhì)瘤的分子病因也就隨之揭曉。4小結(jié)研究膠質(zhì)瘤的分子病因較消化系等其它腫瘤要難得多，原因是后者無(wú)論在臨床上，還是在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的研究上都可明確從正常細(xì)胞演變至癌前病變、原位癌、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移等各個(gè)階段，而膠質(zhì)細(xì)胞的“癌前病變階段很難確立，因?yàn)樗谝话闱闆r下較少增生，雖然在外傷和某些炎癥等情況下可以發(fā)生反響性增生，但沒(méi)有流行病學(xué)資料支持膠質(zhì)瘤的發(fā)生與膠質(zhì)細(xì)胞反響性增生有關(guān)。在已經(jīng)制作成功的基因工程鼠腦膠質(zhì)瘤模型中也沒(méi)有見(jiàn)到膠質(zhì)瘤的“癌前變化，而一開場(chǎng)就是H分類屬于級(jí)和級(jí)以上的惡性度高的膠質(zhì)瘤。從目前的膠質(zhì)瘤分子生物學(xué)研究成果來(lái)看，受上述條件限制，僅對(duì)膠質(zhì)瘤發(fā)生后惡性進(jìn)展的信號(hào)傳導(dǎo)通路有所