1、凝膠過濾層析凝膠過濾層析定義凝膠過濾層析是生化分離常用色譜技術的一種。利用具有網狀結構的凝膠的分子篩作用,根據被分離物質的分子大小不同來進行分離，也被稱為體積排阻層析（size exclusion chromatography）、分子篩層析（Molecular Sieve Chromatography）、凝膠滲透層析（Gel Permeation Chromatography）定義凝膠過濾層析是生化分離常用色譜技術的一種。應用凝膠層析法適用于分離和提純蛋白質、酶、多肽、激素、多糖、核酸類等物質。分子大小彼此相差25%的樣品，只要通過單一凝膠床就可以完全將它們分開。利用凝膠的分子篩特性，可對這些

2、物質的溶液進行脫鹽、去熱源和脫色。應用凝膠層析法適用于分離和提純蛋白質、酶、多肽、激素、多糖、原理凝膠是一類多孔性高分子聚合物，每個顆粒猶如一個篩子。當樣品溶液通過凝膠柱時，相對分子質量較大的物質沿著凝膠顆粒間的孔隙，隨著溶劑流動，首先流出層析柱；相對分子質量較小的物質可自由地進出凝膠顆粒的網孔，使流量增長，移動速率慢而最后流出層析柱。中等大小的分子在大分子物質與小分子物質之間被洗脫。這樣，經過層析柱，混合物中的各物質按其分子大小不同而被分離。帶網孔的葡聚糖珠小分子進入葡聚糖珠內大分子不能進入珠內，經珠之間縫隙流出原理凝膠是一類多孔性高分子聚合物，每個顆粒猶如一個篩子。帶網固定相（凝膠）三維空

3、間網狀結構樣品固定相流動相小分子被延滯小分子大分子較快流出分子篩效應： 按分子大小不同,在凝膠受到的阻滯作用有差異,從而造成各組分在凝膠柱中的遷移速度不同得到分離。固定相（凝膠）三維空間網狀結構樣品固流小分子小分子大分子較基本概念外水體積(Vo)是指凝膠柱中凝膠顆粒周圍空間的體積，也就是凝膠顆粒間液體流動相的體積。內水體積(Vi)是指凝膠顆粒中孔穴的體積。基質體積(Vg)是指凝膠顆粒實際骨架體積。柱床體積(Vt)就是指凝膠柱所能容納的總體積。洗脫體積(Ve)是指將樣品中某一組分洗脫下來所需洗脫液的體積凝膠層析柱各種體積示意圖（陰影部分）基本概念外水體積(Vo)是指凝膠柱中凝膠顆粒周圍空間的體積

4、，分配系數（Kd） Ve=Vo+KdVi(2)Ve = Vo + Vi，Kd = 1分子完全不被排阻完全向凝膠顆粒內部擴散在兩相分配的比值為1,最后流出(1)Ve = Vo，Kd = 0分子完全被排阻于凝膠顆粒之外全部分布于流動相里最先流出(3) 0 Kd 1，Ve = Vo +ViKd為溶質以某種程度向凝膠顆粒內擴散每個溶質分子在流動相和固定相之間有一個特定的分配系數特點：與被分離物質分子的大小和凝膠顆粒孔隙的大小有關 Kd=0 0Kd1 Kd=1洗脫體積小分子量大分子量分配系數（Kd） Ve=Vo+KdVi(2)Ve 典型的凝膠類型交聯葡聚糖凝膠：Sephadex聚丙烯酰胺凝膠：Sepha

5、cryl 瓊脂糖凝膠：Sepharose和Bio-Gel其它：有機凝膠Sepharon，交聯聚醚Toyopeal，纖維素凝膠，改性剛性填料等典型的凝膠類型交聯葡聚糖凝膠：Sephadex葡聚糖凝膠葡聚糖凝膠（Sephadex）具有良好的化學穩(wěn)定性，是目前生化產品制備中最常用的凝膠?；竟羌埽浩暇厶牵╠extran）;交聯劑：3-氯-1 ,2-環(huán)氧氯丙烷使葡聚糖之間通過醚鍵交聯聚合而成的三維空間網狀結構葡聚糖凝膠網孔大小可通過調節(jié)交聯劑和葡聚糖的配比及反應條件來控制。交聯度越大，網孔越小，吸水膨脹就越小。交聯度越小，網孔越大，吸水膨脹就越大Sephadex G系列凝膠的分級范圍 G10 700

6、DG15 1,500G25 1,000 5,000G-50 1,50030,000G-75 3,00070,000G100 4,000 150,000G150 5,000 400,000G200 5,000 800,000交聯葡聚糖凝膠的化學結構 葡聚糖凝膠葡聚糖凝膠（Sephadex）具有良好的化學穩(wěn)定性葡聚糖凝膠1理化性質葡聚糖凝膠的外觀為白色珠狀顆粒。它帶有大量的羥基，親水性好，因此在水溶液或電解質溶液中極易膨脹。由于各種型號的葡聚糖凝膠的交聯度不同，致使如下理化性質在水中的有明顯的差異： 膨脹度(床體積) 吸水量(每克干凝膠在水中充分膨脹時所需的水量) 篩孔的大小 分級范圍葡聚糖凝膠的

7、型號不同，其性質亦不一樣葡聚糖凝膠1理化性質分類以G型葡聚糖凝膠(經水溶液膨脹)作為固定相，以水溶液作為流動相，對水溶性物質進行分離的層析方法稱為葡聚糖凝膠過濾層析。以LH型葡聚糖凝膠(經乙醇或二甲亞砜甲酰胺或N、N-二甲基甲酰胺等有機溶劑膨脹)作為固定相，以有機溶劑為流動相，對脂溶性物質進行分離的層析方法稱為葡聚糖凝膠滲透層析。 分類以G型葡聚糖凝膠(經水溶液膨脹)作為固定相，以水溶液作為2穩(wěn)定性 葡聚糖凝膠在水溶液、鹽溶液、堿溶液、弱酸溶液和有機溶劑中是穩(wěn)定的、不溶解的，而且很少產生化學降解。在中性條件下，葡聚糖凝膠懸浮液可置高溫(120)消毒0.5h，其性質并不改變。在0.1molL H

8、Cl溶液中浸泡12h，甚至在0.02molL HCI溶液中浸泡6個月以上，對分離效果無明顯的影響。當暴露于強酸或氧化劑溶液時，則容易使糖苷鍵水解斷裂，因此，要避免與其接觸。葡聚糖凝膠欲在室溫下長期保存時，應加入適量的防腐劑如氯仿、0.05NaN3或20乙醇等，不然微生物將生長。2穩(wěn)定性 3吸附性 葡聚糖凝膠系弱酸性物質，這是由于其每克干膠中含10-20g當量的羧基基團所致。羧基基團能與分離物中電荷基團 (尤其是堿性蛋白質)發(fā)生吸附作用。這種吸附作用可以借助提高洗脫液的離子強度得以克服。 當離子強度大于0.05時，一般對弱堿性蛋白質就無吸附力了。 因此，常用含有NaCl的緩沖液作洗脫液。 3吸附

9、性 瓊脂糖凝膠（商品名為Sepharose)瓊脂糖是從瓊脂中分離出來的。在制備過程要將其中含硫酸根和羧基基團的瓊脂膠除去，得到不帶電荷基團的瓊脂糖。瓊脂糖是由D-半乳糖和3、6脫水的L-半乳糖連接構成的多糖鏈。這種多糖鏈在100左右時呈液態(tài)，當溫度下降到45以下時呈固態(tài)。它們之間以氫鍵方式相互連接就成了線性的雙鏈單環(huán)的瓊脂糖，經凝聚即呈束狀的瓊脂糖凝膠。 瓊脂糖凝膠（商品名為Sepharose)瓊脂糖是從瓊脂中分離該物質對尿素和鹽酸胍等破壞氫鍵的試劑有較強的抵抗力，在pH4.0-9.0的緩沖液中是穩(wěn)定的。瓊脂糖凝膠室溫保存，其物理穩(wěn)定性超過了聚丙烯酰胺和葡聚糖凝膠。瓊脂糖凝膠在干燥狀態(tài)下保存時

10、易破裂，故一般存放在含防腐劑的水溶液中，同時還要避免劇烈的攪動。瓊脂糖凝膠按其濃度來分有Sepharose 2B(2)、4B(4)和6B(6)。 Sepharose 6B的機械強度大于2B，但是篩孔小于2B。該物質對尿素和鹽酸胍等破壞氫鍵的試劑有較強的抵抗力，在pH4瓊脂糖凝膠的機械強度和篩孔的穩(wěn)定性都比葡聚糖凝膠好。用瓊脂糖凝膠進行柱層析時，流速可以快些。大孔凝膠，工作范圍的下限幾乎是 Sephadex的上限可分離MW40萬以上的物質可用來分離核酸及病毒瓊脂糖凝膠的機械強度和篩孔的穩(wěn)定性都比葡聚糖凝膠好。用瓊脂糖三、聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠的商品名稱為Bio-gel。它是以甲撐雙丙烯酰胺

11、(雙體)作交聯劑，以過硫酸銨作催化劑， 在N,N,N,N,- 四甲基乙二胺(TEMED)加速劑的作用下， 將丙烯酰胺(單體)聚合而成的。當改變單體濃度時，就可得到吸水率不同的產物。 三、聚丙烯酰胺凝膠凝膠過濾層析實驗技術1、凝膠的選擇2、凝膠的預處理3、裝柱4、樣品的準備5、上樣6、洗脫和收集7、凝膠的再生及保存凝膠過濾層析實驗技術1、凝膠的選擇凝膠過濾層析實驗技術1、凝膠的選擇選擇適宜的凝膠是取得良好分離效果的最根本的保證。選取何種凝膠及其型號、粒度，一方面要考慮凝膠的性質，包括凝膠的分離范圍（滲入限與排阻限）、理化穩(wěn)定性、強度、非特異吸附性質等。對生物樣品來說，經常遇到的是兩種分離形式。一

12、種是只將分子量極為懸殊的兩類物質分開，如蛋白質與鹽類，稱作類分離或組分離。另一類則是要將分子量相差不很大的物質加以分離，如分離血清球蛋白與白蛋白，這叫做分級分離。后者對實驗條件和操作要求都比較高。凝膠過濾層析實驗技術1、凝膠的選擇類分離目的是分開樣品中分子量懸殊的“較大分子組”和“較小分子組”兩類物質，并不要求分離分子量相近的組分選擇凝膠時，應使樣品中大分子組的分子量大于其排阻限，而小分子組的分子量小于滲入限。也就是說大分子的分配系數Kd=0，小分子的Kd1。這樣能取得最好的分離效果。例題：從某蛋白質溶液（MW=5500D）中除去無機鹽，應選擇下列哪種凝膠最合適？B. Sephadex G-2

13、5（分級范圍，1000-5000 D）A. Sephadex G-15（分級范圍， 1,500 D）C. Sephadex G-150（分級范圍， 5,000-400,000 D）類分離目的是分開樣品中分子量懸殊的“較大分子組”和“較小分子凝膠粒度的影響凝膠粒度的大小對分離效果有直接的影響。一般來說，細粒凝膠柱流速低，但洗脫峰窄，分辨率高，多用于精制分離或分析等。粗粒凝膠柱流速高，但洗脫峰平坦，分辨率低，多用于粗制分離，脫鹽等。在一般柱層析中，使用干顆粒直徑在70m左右較合適。對于在水中保存的凝膠如瓊脂粉凝膠顆粒直徑應在150m左右。凝膠顆粒大小要均勻，這樣流速穩(wěn)定，效果較好同一流速下不同粒度

14、的Sephadex G-25柱的洗脫效果凝膠粒度的影響凝膠粒度的大小對分離效果有直接的影響。一般來說2、凝膠的預處理溶脹：稱取適量凝膠干粉，用約10倍蒸餾水浸泡24小時以上或將干膠加入水里，邊加邊攪，然后放到沸水浴中加熱接近100，保持數個小時。根據干凝膠的填充體積計算所需的干凝膠量平衡：用起始緩沖液浸泡凝膠，直至凝膠液pH與起始緩沖液相同（使凝膠溶脹狀態(tài)穩(wěn)定）2、凝膠的預處理溶脹：稱取適量凝膠干粉，用約10倍蒸餾水浸泡3、裝柱一般選用細長的層析柱作凝膠過濾。進行類分離（如脫鹽）時，柱高50cm比較合適；分級分離時，100cm較為合適具體步驟為：將層析柱垂直固定，一般是先在柱內裝入約1/3高度

15、的水或緩沖液排走空氣；將平衡好的凝膠攪勻，連續(xù)傾入柱中，待其自然沉降至1/4-1/3高時打開下端出口，讓溶劑慢慢流出，繼續(xù)倒入凝膠至沉降到所需高度。用3-5倍柱床體積的起始緩沖液走柱，使凝膠介質充分平衡，柱床穩(wěn)定（若第一步采用起始緩沖液排空氣則該步驟略）。 層析柱（a）自制簡易層祈柱（1玻璃管；2.橡皮塞；3尼龍網）；（b）普通商品柱；（c）雙底板層析柱（1.洗脫液進出口；2.多孔底板；3柱床；4恒溫水進口；5恒溫水出口；6可調節(jié)的塞子） 3、裝柱一般選用細長的層析柱作凝膠過濾。進行類分離（如脫鹽）4、樣品的準備樣品的粘度：粘度大產生介質吸附，一般要求樣品粘度小于0.01Pas樣品的濃度：樣品

16、濃度以不大于4為宜，樣品濃度過大往往導致粘度增大。如果樣品渾濁，應先過濾或離心除去顆粒后上柱樣品的體積：分析用量一般應低于總柱體積的5%，制備用量一般為15%或更多（20-30%）。 樣品黏度對洗脫曲線的影響（1）加葡萄糖2 000，使終濃度為5%，相對粘度11.8;（2）加葡萄糖2 000，使終濃度為2.5%，相對粘度4.2; （3）加葡萄糖2 000，使終濃度為1%. 4、樣品的準備樣品的粘度：粘度大產生介質吸附，一般要求樣品粘5、上樣具體步驟為：打開層析柱下端出口，使緩沖液流出至剛好達到凝膠膠面沿柱壁緩慢加入樣品，打開下端出口，使樣品溶液流出至剛好達到凝膠膠面，再取少量起始緩沖液洗滌柱壁

17、加樣時應盡量減少凝膠床面的攪動。加樣的方法可以是直接將樣品加到層析床表面，或可用微量泵控制5、上樣具體步驟為：6、洗脫和收集打開起始緩沖液閥門，連續(xù)洗脫。用自動部分收集器自動或手動收集，合并同一高峰各管。洗脫時應注意的問題：流速不宜過快且要穩(wěn)定洗脫液的成分也不應改變（凝膠溶脹程度）整個洗脫過程中始終保持一定的操作壓可以用水或緩沖液作洗脫液 流速對洗脫曲線的影響 流速較低，分辨率較高常用恒流泵控制6、洗脫和收集打開起始緩沖液閥門，連續(xù)洗脫。洗脫時應注意的問7、凝膠的再生及保存再生 用過的凝膠經0.5M的NaOH和HCl溶液分別處理后可以恢復其性能，或參照凝膠產品說明書凝膠的保存方法 0.02%疊氮鈉或0.002%雙氯苯雙胍己烷7、凝膠的再生及保存再生應用：測定相對分子質量標準曲線法 對于特定的測定系統(tǒng)，先以3個以上（越多越好）的已知分子量的標準蛋白（目前已有配套標準蛋白系列產品出售）過柱，測取各自的Ve值。以Ve作縱坐標，LogM作橫坐標制做標準曲線。在同一測定系統(tǒng)中測出未知物質的Ve值便可由標準曲線求得分子量。分子量在10 000150 000之間的球形蛋白用此法測出的分子量誤差在10左右