基因查找，引物設(shè)計(jì)及Real-timePCR2013.11.18Partone---如何查找基因序列、mRNA序列Parttwo

---引物設(shè)計(jì)Partthree

---Real-timePCR原理及應(yīng)用Partfour(Discussing)

------從發(fā)現(xiàn)到分析,再到應(yīng)用解決（臨床問題）Partone---如何查找基因序列、mRNA1.DNA是細(xì)胞核中的雙螺旋結(jié)構(gòu)脫氧核糖核酸鏈，儲(chǔ)存著遺傳信息。DNA包括內(nèi)含子，外顯子。2.由DNA轉(zhuǎn)錄出各種RNA，RNA是單鏈的核糖核酸鏈。RNA包括mRNA，tRNA，rRNA，ncRNA。

(ncRNA是nonecodingRNA的簡(jiǎn)稱，包括miRNAsnRNA,snoRNA,scRNA,tmRNA等。)

3.mRNA從DNA轉(zhuǎn)錄出來后還要剪切掉內(nèi)含子才可用來翻譯蛋白質(zhì)。

4.mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄得到的DNA成為cDNA，因?yàn)閏DNA沒有內(nèi)含子，所以和最初轉(zhuǎn)錄出mRNA的DNA不一樣。NCBI(NationalCenterforBiotechnologyInformation)

mRNA同一個(gè)基因，可能存在不同的isoforms,mRNA序列有所不同，若沒有特別要求，只需擴(kuò)增到該基因的話，PCR引物可以選擇擴(kuò)增幾個(gè)不同序列的公共保守區(qū)的序列。Parttwo

---引物設(shè)計(jì)普通PCR設(shè)計(jì)軟件Real-timePCR設(shè)計(jì)軟件PrimerPremier5.0是由加拿大的Premier公司開發(fā)的專業(yè)用于PCR或測(cè)序引物以及雜交探針的設(shè)計(jì)、評(píng)估的軟件，其主要界面分為序列編輯窗口（Genetank），引物設(shè)計(jì)窗口（PrimerDesign），酶切分析窗口（RestrictionSites）和紋基分析窗口（Motif），這里我們主要介紹其引物設(shè)計(jì)功能。打開程序首先進(jìn)入的是序列編輯參看在結(jié)果窗口中給出了程序給該對(duì)引物的打分（rating）和上下游引物的起始位置和長(zhǎng)度以及產(chǎn)物的長(zhǎng)度。通過直接點(diǎn)擊各對(duì)引物在相應(yīng)引物搜尋界面中相應(yīng)的顯示引物的各種信息。包括其各種參數(shù)和各種可能存在的不利結(jié)構(gòu)。PRIMERPREMIER能即時(shí)分析引物二級(jí)結(jié)構(gòu)在左下的兩排按鈕可以顯示發(fā)現(xiàn)了哪些二級(jí)結(jié)構(gòu)而按下的按鈕表明相鄰的圖框里顯示的是何種二級(jí)結(jié)構(gòu)除了二級(jí)結(jié)構(gòu)圖框里也顯示二級(jí)結(jié)構(gòu)的自由能數(shù)值G單位kcal/molEditPrimer引物編輯窗口可以用來設(shè)計(jì)用于定點(diǎn)突變的引物或分析一條已有引物序列。進(jìn)行粘貼時(shí)Paste粘貼窗口會(huì)激活用以將引物序列轉(zhuǎn)化為反向互補(bǔ)或反向互補(bǔ)形式您也可以手工鍵入引物序列一旦引物被編輯發(fā)生變化Analyze按鈕就可以使用點(diǎn)擊Analyze按鈕即可分析編輯后的引物。參考影響因子高的文獻(xiàn)上的引物序列或好的網(wǎng)站上的（注意種屬?。┳孕幸镌O(shè)計(jì)（軟件）普通PCR

Real-timePCR廠家設(shè)計(jì)合成（eg:Taqman探針法）Real-timePCRRealtimePCR使用SYBRDye的話，對(duì)PCR產(chǎn)物的特異性要求非常高。非特異產(chǎn)物主要是引物二聚體，它的多少可能決定了本實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)靈敏度。熔點(diǎn)曲線和電泳可以檢測(cè)引物二聚體。

SYBR與所有dsDNA結(jié)合，包括引物二聚體（PrimerDimers），這就會(huì)使結(jié)果偏大。

如何消除引物二聚體并提高靈敏度？

理想情況是引物設(shè)計(jì)非常完美，各種試劑的使用量恰到好處，溫度變化與“變性，退火，延伸”完全吻合，使得PCR過程中產(chǎn)生極少引物二聚體，極少有偏差的延伸，極少非目的模板的擴(kuò)增。

（1）設(shè)計(jì)適合RealtimePCR的引物。

AppliedBiosystems公司建議用PrimerPress軟件來專門設(shè)計(jì)realtimePCR引物。

一些常見的基因引物序列可以借鑒其他成功的研究者。

（2）除了尋找合適的序列，還可以改變退火溫度，限制引物的濃度。

（3）減少配試劑到開始反應(yīng)之間的非特異擴(kuò)增。（縮短時(shí)間+冰上操作）

（4）PCR使用熱啟動(dòng)酶，UNG酶。

Partthree

---Real-timePCR原理及應(yīng)用游離時(shí)無熒光信號(hào)和DNA雙鏈結(jié)合時(shí)，發(fā)出熒光每次實(shí)驗(yàn)都必須同時(shí)擴(kuò)增內(nèi)參基因Partfour(Discussing)

---從發(fā)現(xiàn)到分析,再到應(yīng)用解決（臨床問題）基因研究平臺(tái)少量樣本數(shù)更多樣本數(shù)少量基因Genome-wideSurvey>10,000基因Pathwayfocesedsurey30-1000基因Iontorrent高通量測(cè)序平臺(tái)全基因組mRNA/小RNA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)新RNA分子高密度全基因組雜交芯片microArray全基因組檢測(cè)已知mRNA低密度TaqManArray單個(gè)信號(hào)通路/基因家族/疾病關(guān)聯(lián)基因/microRNA檢測(cè)個(gè)別基因real-timePCR檢測(cè)TaqManArraysTaqMan芯片——TaqManArrayFamily96孔板TaqManArrayPlate384孔TaqManArray(低密度芯片/微流卡)所有TaqManArray反應(yīng)孔中都預(yù)先固化了TaqMan探針和引物3072孔超高通量熒光定量平臺(tái)OepnArrayTaqMan基因表達(dá)芯片從基因通路網(wǎng)絡(luò)工具(GeneAssist）搜尋目的基因表達(dá)檢測(cè)試劑盒定制成96孔板或384孔微流卡芯片運(yùn)行定量PCR，分析數(shù)據(jù)。同時(shí)分析幾十到上百個(gè)基因表達(dá)Ambion

mirVana?KitsDiscoverytoDiagnosticsAnti-miR?miRNAInhibitors&Pre-miR?miRNAPrecursors

TaqMan?

miRNAArray&7900HTTaqMan?

miRNA

AssaysIonTorrentTMNextGenSequencingRNAIsolation

Discovery

Profile

microRNAs

Validate

FunctionalStudies