血清肌酐的測定（去蛋白的堿性苦味酸法測定）

尿酸酶法測定血清尿酸

1.掌握測定血清肌酐、尿酸的原理和方法2.理解血中肌酐、尿酸含量變化的生理意義目的要求肌酐是肌肉在人體內(nèi)代謝的產(chǎn)物，每20g肌肉代謝可產(chǎn)生1mg肌酐。肌酐主要由腎小球濾過排出體外。血中肌酐來自外源性和內(nèi)源性兩種，外源性肌酐是肉類食物在體內(nèi)代謝后的產(chǎn)物；內(nèi)源性肌酐是體內(nèi)肌肉組織代謝的產(chǎn)物。在肉類食物攝入量穩(wěn)定時.身體的肌肉代謝又沒有大的變化，肌酐的生成就會比較恒定。血清肌酐的濃度變化主要由腎小球的濾過能力(腎小球濾過率)來決定。濾過能力下降，則肌酐濃度升高。

血清肌酐檢測，臨床上主要用于腎功能的判定。人體腎臟功能有很強的儲備和代償能力，只有在其濾過功能下降到正常的1/3以下時，血清肌酐才明顯上升。因此血清肌酐測定不能反映腎臟的早期病變。而在腎功能受損后,血清肌酐濃度的高低與病情嚴(yán)重程度成正比。測定方法

（1）Jaffe反應(yīng)法（苦味酸法）：肌酐與堿性苦味酸作用，生成黃紅色化合物，在510nm處比色分析。是測定肌酐常用的方法，適用于血、尿標(biāo)本的檢測。但最大的問題是非特異性干擾大（假肌酐）。（2）酶偶聯(lián)速率法：在340nm處監(jiān)測吸光度值的降低，可測量肌酐含量。特異性高，適用于自動化分析。但試劑價格昂貴且不易保存。血漿或血清標(biāo)本經(jīng)去除蛋白處理后，肌酐與堿性苦味酸產(chǎn)生Jaffe反應(yīng)，在堿性環(huán)境中生成橙紅色的苦味酸肌酐復(fù)合物，此加成反應(yīng)的具體反應(yīng)機制尚未完全闡明，在510nm和520nm之間測定吸光度，顏色的深淺與肌酐的濃度成正比。實驗原理1，取血清或血漿0.5ml，加入35mmol/L的鎢酸溶液4.5ml,充分混勻，靜置5min,3000r/min，離心10min，取上清液；若為尿液標(biāo)本用去離子水作1：200稀釋。2，按表操作實驗操作加入物(ml)空白管標(biāo)準(zhǔn)管測定管血清無蛋白濾液3.0－－肌酐標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液－3.0－去離子水－－3.0苦味酸溶液1.01.01.0氫氧化鈉溶液1.01.01.0混勻后室溫15min，波長510nm，空白管調(diào)零，讀取各管吸光度。

×10男性：44-133；女性：70-106umol/L實驗結(jié)果參考范圍血液肌酐經(jīng)腎小球過濾，腎小管既不重吸收，也不分泌，即腎對肌酐的排泄能力強，因而腎疾病早期血漿肌酐通常不高，在反映腎小球濾過率下降方面，血肌酐比血尿素的靈敏度低。但血肌酐受飲食、運動、激素、蛋白質(zhì)代謝等因素的影響較少，所以診斷的特異性比血尿素好。除腎病外，其他組織器官功能的異常也會引起血清肌酐增高。區(qū)別在于腎臟病變引起的腎衰，血清肌酐常超過200μmoI/L。而心力衰竭、休克、水腫等疾病導(dǎo)致腎血流減少，血清肌酐濃度不超過200μmoI/L。

臨床意義1，據(jù)報道堿性肌酐苦味酸復(fù)合物的最大吸光度在485nm，過量苦味酸離子存在于反應(yīng)液中，在波長低于500nm時會產(chǎn)生明顯的吸收。2，反應(yīng)溫度以15-25度為宜，10度以下，會抑制Jaffe反應(yīng)，溫度升高，可使堿性苦味酸溶液顯色增深，但測定管較標(biāo)準(zhǔn)管更為明顯。注意事項3，呈色后標(biāo)準(zhǔn)管色澤較穩(wěn)定，但測定管吸光度隨時間延長而增加，故在加顯色劑后30min內(nèi)比色為宜。4，苦味酸一定要純，否則需純化，若含有雜質(zhì)，則使試劑空白吸光度增加而影響測定結(jié)果。1，特異性血漿中的蛋白質(zhì)和糖、丙酮、維生素C、丙酮酸、乙酰乙酸等均能與堿性苦味酸發(fā)生非特異性反應(yīng)，反應(yīng)速率稍慢。紅細(xì)胞中這類物質(zhì)最多，約有60%，血漿或血清中約20%，尿液約5%。故血清和血漿需制備無蛋白濾液后測定。2，回收率受無蛋白濾液的PH影響，濾液PH在3-4.5時，回收率為85%-90%，PH在2以下時，回收率為100%。3，線性范圍肌酐含量在1320umol/L以內(nèi)線性良好。評價假肌酐：一些具有還原性能與堿性苦味酸生成紅色的物質(zhì)

維生素C、丙酮、乙酰乙酸、α-酮酸、葡萄糖、蛋白質(zhì)以及頭孢菌素類抗生素、強心甙、甲基多巴等排除假肌酐的干擾：①吸附法②速率法二次讀數(shù)法③在手工操作中制備無蛋白濾液或加入十二烷基硫酸鈉去除蛋白質(zhì)干擾，在連續(xù)流動自動化生化分析儀中可采用透析器清除蛋白質(zhì)。④在緩沖液中加入硼酸鹽消除葡萄糖、維生素C的干擾。為去除假肌酐的影響，現(xiàn)在常用速率法來測定血肌酐。速率法亦稱動力學(xué)方法，它是根據(jù)肌酐與堿性苦味酸形成復(fù)合物的速度與假肌酐不同，且肌酐的反應(yīng)速度與濃度成正比的原理。如乙酰乙酸在20s內(nèi)已與堿性苦味酸反應(yīng)完成，其他多數(shù)干擾物則在80s后才與苦味酸有較快的反應(yīng)，而20-80s之間主要是肌酐的反應(yīng)。因此，血清與苦味酸混合后，分別讀取510nm在25s及60s時的吸光度Ao和At，At-Ao除以間隔時間的值與肌酐濃度成正比，借標(biāo)準(zhǔn)液與樣品同樣測定即可求取樣品中的肌酐量?，F(xiàn)在速率法逐漸成為常規(guī)分析法，因為它不需去蛋白，方法簡單、快速，可自動扣除血清及試劑空白吸光度。

尿酸是人體代謝過程中的廢棄物。我們體內(nèi)的老舊細(xì)胞，還有食物，尤其是富含嘌呤的食物（如動物內(nèi)臟、海鮮等）在體內(nèi)新陳代謝過程中，其分解產(chǎn)物就有嘌呤。體內(nèi)產(chǎn)生嘌呤后，會在肝臟中合成為尿酸。尿酸是嘌呤的代謝最終產(chǎn)物。大部分尿酸經(jīng)腎臟隨尿液排出體外，少部分通過糞便和汗液排出。血尿酸濃度受腎小球濾過功能、腎小管重吸收及分泌功能的影響

尿酸酶－酶聯(lián)紫外分光法適合于自動化分析磷鎢酸法無蛋白濾液中的尿酸在堿性條件下使磷鎢酸還原生成藍(lán)色的鎢藍(lán)，可在650～700nm波長下進行比色測定試劑易得、費用低廉，但靈敏度較低尿酸酶-紫外分光法簡單、快速、特異性好、靈敏度高、易于自動化，但需要精密儀器，標(biāo)本中蛋白質(zhì)會提高空白管的吸光度。尿酸酶氧化尿酸，生成尿囊素和過氧化氫，在過氧化物酶催化下，過氧化氫使3，5二氯2-羥苯磺酸和4AAP縮合成紅色醌類化合物（Trinder反應(yīng)）。尿酸濃度與波長520nm吸光度成正比。實驗原理酶偶聯(lián)法操作步驟加入物(ml)空白管標(biāo)準(zhǔn)管測定管血清－－0.1標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液－0.1－去離子水0.1－－酶試劑1.51.51.5

混勻，置室溫10min，波長520nm，空白管調(diào)零，讀取吸光度。實驗操作89-416umol/L實驗結(jié)果參考范圍尿酸測定主要用于各種原因引起的高尿酸血癥，以及由此導(dǎo)致的痛風(fēng)癥。1原發(fā)性高尿酸血癥（1）原發(fā)性腎排泄尿酸減少，占原發(fā)性中80-90%，為多基因性常染色體顯性遺傳所致。（2）尿酸產(chǎn)生過多，以從頭合成嘌呤過多占主要，占原發(fā)性10-20%，也是多基因性常染色體顯性遺傳；而特異性酶缺陷，如次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶部分缺乏或完全缺乏等，導(dǎo)致鳥嘌呤和次黃嘌呤不能經(jīng)補救途徑合成嘌呤核苷酸，而使尿酸產(chǎn)生過多者，僅占原發(fā)性1%。臨床意義2繼發(fā)性高尿酸血癥（1）尿酸排泄減少，為引起腎小球濾過減少和（或）腎小管排泌尿酸減少的腎疾病所致。（2）尿酸產(chǎn)生過多，見于骨髓增殖性疾病如各類白血病、多發(fā)性骨髓瘤、紅細(xì)胞增多癥，慢性溶血性貧血、全身擴散的癌癥，惡性腫瘤化療或放療后和嚴(yán)重的剝脫性牛皮癬等。1，草酸鉀與磷酸容易形成不溶性的磷鎢酸鉀，造成顯色液混濁，因此不能用草酸鉀作為抗凝劑。標(biāo)本中尿酸在室