1、高級(jí)植物生理學(xué)（專(zhuān)題一）植物生理與分子生物學(xué),二、高等植物基因結(jié)構(gòu)及表達(dá)調(diào)控,1、真核基因組結(jié)構(gòu)特征 2、植 物 的 基 因 組 3、植 物 基 因 的結(jié)構(gòu) 4、植物基因的表達(dá)調(diào)控,啟動(dòng)子,上游調(diào)節(jié)區(qū),起點(diǎn),外顯子1,外顯子2,外顯子3,RNA-5,DNA,一個(gè)結(jié)構(gòu)基因,終點(diǎn),單順?lè)醋? 真核基因是單順?lè)醋樱╟istron），一條成熟的mRNA鏈只能翻譯出一條多肽鏈。原核生物是多基因操縱子。,1、 真核細(xì)胞基因結(jié)構(gòu)的特征,例外：C.elegans 有13500個(gè)基因，約25%是多順?lè)醋印?啟動(dòng)子,上游調(diào)節(jié)區(qū),起點(diǎn),基因1,基因2,基因3,RNA-5,DNA,三個(gè)結(jié)構(gòu)基因,終點(diǎn),多順?lè)醋?大腸桿

2、菌乳糖操縱子mRNA編碼3條多肽鏈，色氨酸操縱子mRNA編碼5條多肽鏈,真核生物 rRNA 基因結(jié)構(gòu),ETS,ITS,不轉(zhuǎn)錄間隔,18S,5.8S,28S,45S rNA前體,rRNA基因,真核rRNA基因是多考貝（中度重復(fù)序列）； 三種rRNA基因總是按18S、5.8S、28S 順序排列； 此基因簇是串聯(lián)重復(fù)的，簇與簇之間由不轉(zhuǎn)錄間隔分開(kāi)； 間期核中rDNA濃縮成核仁，在核仁中被轉(zhuǎn)錄、加工。,18S 5.8S 28S,核小體,DNA 核小體 螺線管 超螺線管 染色單體, 真核基因組是以染色體（質(zhì)）形式存在，小部分DNA是裸露的。,DNA(基因),mRNA,編碼區(qū),尾部區(qū),起始密碼,終止密碼,

3、extron,intron,前導(dǎo)區(qū), 真核基因組中存在著重復(fù)序列。 高度重復(fù)序列；中度重復(fù)序列；單一序列。, 真核基因?qū)儆跀嗔鸦颍幋a序列中存在有內(nèi)含子。, 真核基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)很大，可遠(yuǎn)離啟動(dòng)子上千個(gè)堿基。 真核基因的表達(dá)轉(zhuǎn)錄和翻譯存在著時(shí)間和空間間隔。 真核基因表達(dá)的調(diào)控可從染色體結(jié)構(gòu)至翻譯后加工多個(gè)層次（水平）上進(jìn)行。,原核生物基因表達(dá),真核細(xì)胞基因表達(dá),2、植物的基因組,基 因 （gene）？ 基因組 （genome）？ 基因組學(xué) （genomics）？,遺傳物質(zhì)單元，在染色體上占據(jù)特定位置、具有某種特定遺傳功能的 DNA 序列。 編碼一個(gè)完整mRNA的一段DNA序列。,基因有兩個(gè)特點(diǎn)

4、： 一、忠實(shí)復(fù)制自己：以保持生物的基本特征； 二、基因能夠突變：為自然選擇貯備了材料；,基因是遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)，是DNA分子上具有遺傳信息的特定核苷酸序列的總稱(chēng)，是具有遺傳效應(yīng)的DNA分子片段?；蛲ㄟ^(guò)復(fù)制把遺傳信息傳遞給下一代，使后代出現(xiàn)與親代相似的性狀。,突變絕大多數(shù)會(huì)導(dǎo)致疾病，另外的一小部分是非致病突變。非致病突變給自然選擇帶來(lái)了原始材料，使生物可以在自然選擇中被選擇出最適合自然的個(gè)體。,基因可分為： 結(jié)構(gòu)基因：編碼蛋白質(zhì)的基因。包括編碼酶和結(jié)構(gòu)蛋白的基因； 調(diào)節(jié)基因：編碼作用于結(jié)構(gòu)基因的阻遏蛋白或激活蛋白的基因； 沒(méi)有翻譯產(chǎn)物的基因：RNA基因，轉(zhuǎn)錄成為 tRNA和rRNA基因； 不轉(zhuǎn)錄

5、的DNA區(qū)段：調(diào)控序列，如啟動(dòng)子、操縱子、增強(qiáng)子等等。 （順式作用元件）,基因的屬性：結(jié)構(gòu)單位，功能單位，突變單位。,基因組：一個(gè)生物遺傳物質(zhì)的總和。 細(xì)胞中的全部DNA。,植物的基因組： 細(xì)胞核基因組 + 細(xì)胞質(zhì)基因組,葉綠體基因組+線粒體基因組,基因組學(xué)：研究基因組的結(jié)構(gòu)、功能和進(jìn)化的科學(xué)。,基因組研究包括兩方面的內(nèi)容： 以全基因組測(cè)序?yàn)槟繕?biāo)的結(jié)構(gòu)基因組學(xué)（structural genomics） 以基因功能鑒定為目標(biāo)的功能基因組學(xué)（functional genomics),2.1 植物基因組的復(fù)雜性,（3）植物基因組中重復(fù)序列變化極大; 擬南芥和一些多倍體植物中: 20%; 小麥、豌豆中

6、，80%以上基因是重復(fù)序列；,（1）植物除了細(xì)胞核基因組外，還有細(xì)胞質(zhì)基因組；,（2）植物基因組的長(zhǎng)度差異是整個(gè)生物界最大的； 擬南芥單倍體基因組：6.3107 bp； 百 合單倍體基因組：1.01011 bp；,一些物種細(xì)胞核基因組(二倍體)大小,基因組的復(fù)雜性是指基因組中不同序列的總和，用DNA變性和復(fù)性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)；可用參數(shù)：Co t1/2 表示；,Co：復(fù)性時(shí)相同（單鏈）DNA的濃度；t：復(fù)性的時(shí)間 Co t1/2：一半DNA復(fù)原成雙鏈所用的時(shí)間； 基因組越復(fù)雜， Co t1/2 值越大。,基因組的序列可分為單一序列（single copy sequence） 和重復(fù)序列（repetiti

7、ve sequence）,植物基因組中的重復(fù)序列：,高度重復(fù)序列：重復(fù)幾百萬(wàn)次，一般是少于10 bp的片段； 中度重復(fù)序列：幾十到上千次，約 300500 bp相近順序 ； 單一序列： 在基因組中只出現(xiàn)一次或少數(shù)幾次的序列。,串聯(lián)重復(fù)序列（tandemly repeated sequences）： 重復(fù)序列以各自的核心序列（重復(fù)單元）首尾相連多次重復(fù) ，重復(fù)序列間被間隔序列分開(kāi)。,散布重復(fù)序列（dispersed Repeated Sequence ）： 主要是一些可移位的遺傳因子：轉(zhuǎn)座子和逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子。,rRNA 基因：,ETS,ITS,不轉(zhuǎn)錄間隔,18S,5.8S,28S,45S rNA前

8、體,rRNA基因,串聯(lián)重復(fù)，簇之間由不轉(zhuǎn)錄間隔分開(kāi)；,18S 5.8S 28S,衛(wèi)星DNA（satellite DNA）： 動(dòng)物的衛(wèi)星DNA富含AT；植物衛(wèi)星DNA富含GC；,端粒重復(fù)序列：真核生物間高度保守； 人和椎蟲(chóng)：TTAGGG； 擬南芥和小麥：TTTAGGG,葉綠體基因組（chloroplast genome）：,多數(shù) 被子植物 cpDNA在120160kb之間； 含有87183個(gè)已知基因；,煙 草 86684,25339,18482,25339,LSC,SSC,IRA,IRB,rRNA,rRNA,4 rRNA基因、30 tRNA基因、4 RNA聚合酶基因、21核糖體蛋白質(zhì)基因、31光

9、合作用相關(guān)基因、40其它蛋白質(zhì)基因。,擬南芥 84170,26264,17780,26264,已知DNA序列的植物質(zhì)體基因組,cpDNA存在于“類(lèi)核體（nucleoid）”中，葉綠體中可有1020個(gè)類(lèi)核體（每個(gè)可有220個(gè)DNA分子）。,線粒體基因組（mitochondrial genome）,植物mtDNA長(zhǎng)度變異很大，1952600kb； 動(dòng)物mtDNA為1518kb；真菌在1878kb； 基因組的大小并不表示基因數(shù)量的多少：,擬南芥mtDNA 376kb ，人mtDNA為16.6kb，前者比后者RNA基因多1個(gè)，蛋白質(zhì)基因27:13。 在同一細(xì)胞 中可有不同長(zhǎng)度的mtDNA。,mtDNA

10、有分子內(nèi)、分子間重組，也可與核、葉綠體基因組DNA重組。因此mtDNA的重排、序列加倍、與外源DNA整合的幾率很高，由此產(chǎn)生新的嵌合基因。細(xì)胞質(zhì)雄性不育就是由于新的嵌合基因?qū)е碌摹?植物細(xì)胞內(nèi)的三類(lèi)基因組存在著廣泛的相互作用。 葉綠體和線粒體的結(jié)構(gòu)蛋白多數(shù)由核基因組編碼： 細(xì)胞器基因 轉(zhuǎn)移至核基因組；,也有基因從核基因組轉(zhuǎn)移至細(xì)胞器基因組: 核糖體L23蛋白質(zhì)基因。,葉綠體、線粒起源：馬古利斯的內(nèi)共生理論,分子生物學(xué)證據(jù)： 1、線粒體和葉綠體僅能來(lái)自已有的線粒體和葉綠體； 2、基因組結(jié)構(gòu)與原核生物相似； 3、有自已的蛋白質(zhì)合成體系，且與原核生物相似； 4、能抑制細(xì)菌RNA聚合酶的抗生素也能抑制

11、線粒體 和葉綠體RNA聚合酶。 5、葉綠體基因結(jié)構(gòu)中有象細(xì)菌那的啟動(dòng)子、操縱子結(jié)構(gòu)。,2.2 基因組學(xué)簡(jiǎn)介,1995，第一個(gè)細(xì)胞生物，流感嗜血菌基因組1.8Mb測(cè)序完成； 1996，第一個(gè)真核生物，啤酒酵母基因組12Mb測(cè)序完成； 1998，第一個(gè)動(dòng)物，美麗線蟲(chóng)基因組（97Mb）測(cè)序完成； 2000，第一個(gè)昆蟲(chóng)，果蠅基因組（120Mb）測(cè)序完成； 2000，第一個(gè)植物，擬南芥基因組（125Mb）測(cè)序完成； 2001，第一個(gè)哺乳動(dòng)物，人的基因組（3100Mb）測(cè)序完成； 2002，第一個(gè)重要作物，水稻基因組（430Mb）測(cè)序完成；,599病毒，205種自然質(zhì)粒，185種細(xì)胞質(zhì)基因組，31種細(xì)菌；

12、,擬南芥：十字花科，擬南芥屬； 基因組較簡(jiǎn)單：染色體n=5 核基因組=1億bp。 生命周期短，種子產(chǎn)量大： 一代的時(shí)間為35周 單株可產(chǎn)無(wú)數(shù)粒種子； 之稱(chēng)為植物中的“果蠅”,模式植物,基因組分析中包含的內(nèi)容較多，主要分為三個(gè)緊密相連的部分，即作圖、通過(guò)突變體研究基因功能和基因克隆及測(cè)序。,突變體的研究 擬南芥基因組研究的目標(biāo)之一，是利用基因突變的方法研究基因功能。 基因突變的方法包括化學(xué)誘變，放射性照射，T-DNA或轉(zhuǎn)座子插入等。,若按擬南芥菜的基因組中有25000個(gè)單拷貝的轉(zhuǎn)錄單位來(lái)算，現(xiàn)在已鑒定了的基因位點(diǎn)約為這些轉(zhuǎn)錄單位的六分之一。,通過(guò)對(duì)胚胎及幼苗致死突變體的研究，發(fā)現(xiàn)大約有4000多

13、個(gè)基因位點(diǎn)與胚胎及幼苗致死有關(guān)； 對(duì)葉綠素缺陷型植物的研究又鑒定了500多個(gè)新的基因位點(diǎn)。,基因組學(xué)研究的具體內(nèi)容有： （1）建立以互聯(lián)網(wǎng)為平臺(tái)的數(shù)據(jù)庫(kù)； （2）組建基因組的物理圖譜和遺傳圖譜； （3）確定基因及基因組的序列； （4）分析基因組的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)； （5）鑒定基因組中所有基因，并確定其功能； （6）建立基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)； （7）建立基因及表型之間的關(guān)系（功能基因組學(xué)）； （8）確定DNA的復(fù)雜性； （9）為比較不同生物的基因組提供資料；,世界上有三大基因序列數(shù)據(jù)庫(kù)： 美國(guó)“國(guó)家生物技術(shù)信息中心”（NCBI）主持的Gene Bank： http//,

14、“歐洲生物信息學(xué)研究所”(EBI)主持的 EMBL 數(shù)據(jù)庫(kù)； http/www.ebi.ac.uk/embl/,日本“國(guó)家遺傳學(xué)研究所”(NIG)主持的日本DNA數(shù)據(jù)庫(kù)(DDBJ) http/www.ddbj.nig.ac.jp/,基因的命名：,植物基因命名委員會(huì)： Commission on Plant Gene Nomenclature，CPGN 根據(jù)基因序列，把植物基因分成不同的家族； CPGN規(guī)定：基因符號(hào)最多8個(gè)： XyzN，核基因組基因； xyzN，細(xì)胞質(zhì)基因組基因,根據(jù)突變型的表型命名：基因名稱(chēng)與正常功能相反； 矮化基因高生長(zhǎng)基因,基因符號(hào)用三個(gè)斜體字母表示，基因產(chǎn)物用正體大寫(xiě)：

15、 突變型基因用小寫(xiě)：abc 野生型基因用大寫(xiě)：ABC ABC是該基因的產(chǎn)物 Abc+指 ABC 基因的表型（野生型）； Abc- 指 abc 基因的表型（突變型）；,ABC1 和 ABC2 是不同的基因； abc4-1 和 abc4-2為相同基因的不同等位基因；,3 植物基因的結(jié)構(gòu),某種生物全部基因的克隆總體基因組文庫(kù),克隆植物中編碼蛋白質(zhì)基因的方法：, 根據(jù)蛋白質(zhì)測(cè)序結(jié)果，合成一段寡聚探針，從該植物的基因組文庫(kù)與 cDNA (complementary DNA)文庫(kù)中分別釣出編碼該蛋白質(zhì)的基因與 cDNA克隆。,克隆與基因組文庫(kù)的構(gòu)建,文 庫(kù) 的 構(gòu) 建,cDNA,探針是一段與目的基因有互補(bǔ)

16、序列的用放射性同位素（32P）標(biāo)記的 DNA 或 RNA分子。,利用“探針”分子釣取目的基因,構(gòu)建基因文庫(kù)的目的主要是為了直接從基因組中分離目的基因，有了基因文庫(kù)后，目的基因的制備可以理解為從基因文庫(kù)中“釣出”目的基因。,兩條來(lái)源不同的具有一定同源性（即具有堿基互補(bǔ)關(guān)系）的DNA單鏈分子或DNA單鏈與RNA分子經(jīng)退火形成雙鏈DNA分子或DNA-RNA異質(zhì)雙鏈分子的過(guò)程稱(chēng)為核酸分子雜交。,核酸分子雜交,電泳分離,轉(zhuǎn)膜,探針雜交,放射顯影,核酸分子雜交操作程序, 根據(jù)蛋白質(zhì)測(cè)序結(jié)果，合成一對(duì) 或數(shù)對(duì)PCR 引物，以植物總DNA為模板，擴(kuò)增出目標(biāo)基因片段。,以此片段為探針，從基因組文庫(kù)與 cDNA文

17、庫(kù)中分別釣出編碼該蛋白質(zhì)的基因與 cDNA克隆。, 基因產(chǎn)物不明，但知道基因突變后的表型，可用轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法分離基因。,顯性純合子,隱性純合子,雜合子 顯性表型,雜合子 突變表型,隱 性突變株,正常未突變株,基因組文庫(kù) I,基因組文庫(kù)II,轉(zhuǎn)座子探針,帶轉(zhuǎn)座子DNA片段,完整目的基因,亞克隆探針, 利用RFLP圖譜，找出與所要克隆基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，用染色體步行法找到所要克隆的基因。,A,B,已知基因,未知基因,步行探針,間隔100Kb, 核DNA減法克隆。利用缺失突變體與同源親本12DNA片段的差異克隆目的基因。, 如果該基因受某種因素誘導(dǎo)表達(dá)，可用mRNA差異顯示法找到所要克隆的基因。,

18、克隆到基因與cDNA后，測(cè)序，對(duì)比基因全序列與 cDNA序列，了解基因結(jié)構(gòu)：如轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，內(nèi)含子數(shù)量、位置及長(zhǎng)度，終止密碼與加尾信號(hào)的位置等。,通過(guò)對(duì)比研究，表明植物基因結(jié)構(gòu)與其它真核基因結(jié)構(gòu)相似，主要由4個(gè)結(jié)構(gòu)區(qū)域組成。 5上游區(qū)、5非翻譯區(qū)、編碼區(qū)、3非翻譯區(qū),5上游區(qū),5非翻譯區(qū),編碼區(qū),3非翻譯區(qū),高等植物基因結(jié)構(gòu),增強(qiáng)子,啟動(dòng)子,CAAT,TATA,Cap,ATG,信號(hào)肽,內(nèi)含子,AATAAA,外顯子1,外顯子2,多聚腺苷酸,終止序列,+1,3.1 5上游區(qū):,轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)5端上游一段很長(zhǎng)的區(qū)域，包含啟動(dòng)子在內(nèi)的與基因表達(dá)起始和表達(dá)調(diào)控有關(guān)的許多元件。,NNNNNNCTCATCANNN

19、,+1,+7,8,該區(qū)域結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是： 基因啟動(dòng)區(qū)序列中，在轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)附近有一一致序列（consensus sequence）：CTCATCA，其中的一個(gè)A 為轉(zhuǎn)錄起始核苷酸，此 A 編為 +1，轉(zhuǎn)錄本中為正數(shù)，此A 的上游用負(fù)數(shù)表示。,在 75 附近 處常有GC（T/C）CAATCT一致序列，簡(jiǎn)稱(chēng)CAAT box，確定RNA聚合酶結(jié)合部位，具有增強(qiáng)基因轉(zhuǎn)錄的作用。, 在上游 32 7有一段TCACTATATAG一致順序： 簡(jiǎn)稱(chēng)：TATA box。 該序列是RNA聚合酶II準(zhǔn)確起始轉(zhuǎn)錄所必需的。,增強(qiáng)子,啟動(dòng)子,CAAT,TATA,Cap,ATG,信號(hào)肽,內(nèi)含子,AATAAA,外顯子1,外顯子2,

20、多聚腺苷酸,終止序列, 在5遠(yuǎn)上游區(qū)，存在對(duì)基因表達(dá)有增強(qiáng)或抑制作用、決定基因表達(dá)特定時(shí)空順序以及對(duì)激素和外界脅迫起應(yīng)答作用的序列 順式作用元件（cis-acting element）,轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)到 CAAT box 附近這一區(qū)段稱(chēng)為啟動(dòng)子。,GC box：110附近的GGGCGG保守序列，確定RNA聚合酶結(jié)合部位。,3.2 5非翻譯區(qū):,5非翻譯區(qū),增強(qiáng)子,啟動(dòng)子,CAAT,TATA,Cap,ATG,信號(hào)肽,內(nèi)含子,AATAAA,外顯子1,外顯子2,多聚腺苷酸,終止序列,轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)到翻譯起始密碼子之間的序列。該序列 5端是前體 mRNA 加帽位點(diǎn)。,3.3 編碼區(qū):,起始密碼到終止密碼之間的序列

21、。 有時(shí)專(zhuān)指外顯子（extron）部分。, 多數(shù)植物基因轉(zhuǎn)錄本 5 有一個(gè)起始密碼 AUG， 少數(shù)植物 5 有4個(gè) AUG，但真正起始密碼是第四個(gè)。 翻譯起點(diǎn)的共有序列： 植物：C（G）AANNATGG 動(dòng)物：A（G）- NNATGG,轉(zhuǎn)錄的基本原則堿基互補(bǔ)： A=T G=C A=U,也稱(chēng)“GT-AG法則”, 編碼區(qū)中常有數(shù)目不等的內(nèi)含子（intron）。 外顯子與內(nèi)含子交界處共有序列是： 外顯子 AG GTAAGT 內(nèi)含子 TCNAG G 外顯子, 外顯子中4種堿基比例： 單子葉植物：AT 含量 43 %； 雙子葉植物：AT 含量 54 %；,Cap,ATG,信號(hào)肽,內(nèi)含子,AATAAA,外

22、顯子1,外顯子2,多聚腺苷酸,AG GTAAGT,NCAG G,內(nèi)含子共有4種，具有核酶性質(zhì)： I 類(lèi)內(nèi)含子： 主要存在于rRNA和質(zhì)體tRNA基因 中， 中間部分高度保守； II 類(lèi)內(nèi)含子：主要存在于線粒體和質(zhì)體mRNA基 因中，拼接點(diǎn)的序列高度保守； III 類(lèi)內(nèi)含子：主要存在于核mRNA基因中； IV 類(lèi)內(nèi)含子： 存在于核tRNA基因中；,3.4 3非翻譯區(qū):,3末端有轉(zhuǎn)錄本mRNA的加尾信號(hào)：AATAAA,A98A86T98A98A95A96,終止密碼后的序列，也有一些調(diào)控序列，對(duì)mRNA的穩(wěn)定性和翻譯效率起調(diào)節(jié)作用。,3 種終止密碼使用的頻率為： 單子葉植物：TGA 46 %，TAA

23、 28 %，TAG 26 % 雙子葉植物：TAA 46 %， TGA 36 %，TAG 18 %,前導(dǎo)區(qū),編碼區(qū),尾部區(qū),DNA,+1,起始密碼,終止密碼,信號(hào)肽序列,加尾信號(hào),mRNA,5 端帽子結(jié)構(gòu) m7G 5PPP 5 NP,3 端polyA尾巴 20200 base,真核細(xì)胞 mRNA 的結(jié)構(gòu),4 植物基因的表達(dá)調(diào)控,真核基因表達(dá)調(diào)控的顯著特征是： 能在特定時(shí)間、特定空間的細(xì)胞中激活特定基因，從而實(shí)現(xiàn)“預(yù)定”的、有序的、不可逆的分化、發(fā)育過(guò)程;,并使生物的組織、器官在一定的環(huán)境條件范圍內(nèi)保持正常功能。,大腸桿菌乳糖操縱子結(jié)構(gòu),根據(jù)調(diào)控的性質(zhì)可分： 瞬間調(diào)控可逆調(diào)控。相當(dāng)于原核細(xì)胞對(duì)環(huán)境

24、條件變化做出的反應(yīng)。包括某種底物或激素水平升降時(shí)，對(duì)細(xì)胞周期不同階段中酶活性和濃度的調(diào)節(jié)。, 生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控不可逆調(diào)控。真核基因調(diào)控的精髓部分，基因按“預(yù)定”的時(shí)、空順序表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)生長(zhǎng)、分化、發(fā)育的全過(guò)程。,在植物的生命周期中，基因表達(dá)具有時(shí)空專(zhuān)一性（生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)程專(zhuān)一性和細(xì)胞、組織、器官特異性），同時(shí)受環(huán)境因素的影響。,持家基因（管家基因）； 時(shí)、空專(zhuān)一性表達(dá)基因； 環(huán)境因素誘導(dǎo)表達(dá)基因；,持家基因表達(dá)水平受環(huán)境因素影響較小，在個(gè)體各個(gè)生長(zhǎng)階段幾乎全部組織中持續(xù)表達(dá)，或變化很小，因此常存在于生物細(xì)胞核的常染色質(zhì)中。,持家基因(house-keeping genes)：又稱(chēng)管家基因，是指所有細(xì)

25、胞中均要表達(dá)的一類(lèi)基因，其產(chǎn)物是對(duì)維持細(xì)胞基本生命活動(dòng)所必需的。,持家基因是一類(lèi)始終保持著低水平甲基化并且一直處于活性轉(zhuǎn)錄狀態(tài)的基因。,持家基因的表達(dá)只受啟動(dòng)序列或啟動(dòng)子與RNA聚合酶相互作用的影響，而不受其他機(jī)制調(diào)節(jié)。在組成型啟動(dòng)子調(diào)控下，不同組織器官和發(fā)育階段的基因表達(dá)沒(méi)有明顯差異 。,目前使用最廣泛的組成型啟動(dòng)子是花椰菜花葉病毒（CaMV）35S 啟動(dòng)子、來(lái)自根癌農(nóng)桿菌Ti 質(zhì)粒T-DNA 區(qū)域的冠癭堿合成酶基因啟動(dòng)子（Nos、Ocs 啟動(dòng)子），后者雖來(lái)自細(xì)菌，但具有植物啟動(dòng)子的特性。,由于組成型啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的基因在各組織中均有一定程度表達(dá)，應(yīng)用中存在一定問(wèn)題。如外源基因在整株植物中表達(dá)，

26、產(chǎn)生大量異源蛋白或代謝產(chǎn)物在植物體內(nèi)積累，打破植物原有代謝平衡，有些產(chǎn)物對(duì)植物并非必需甚至有毒，因而阻礙了植物的正常生長(zhǎng)，甚至導(dǎo)致死亡。,另外，重復(fù)使用同一種啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)兩個(gè)或兩個(gè)以上的外源基因可能引起基因沉默或共抑制現(xiàn)象。因此，人們尋找更為有效的組織、器官特異性啟動(dòng)子代替組成型啟動(dòng)子，以更好地調(diào)控植物基因表達(dá)。,時(shí)、空專(zhuān)一性表達(dá)基因： 這類(lèi)基因的表達(dá)往往只限于生長(zhǎng)發(fā)育的特定時(shí)期，以及某些特定的器官組織中，并表現(xiàn)出生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)節(jié)特性。,基因組織特異性表達(dá)通常是以組織細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和化學(xué)、物理信號(hào)為基礎(chǔ)，通過(guò)組織特異性啟動(dòng)子活動(dòng)實(shí)現(xiàn)的。組織特異性啟動(dòng)子能使目的基因的表達(dá)產(chǎn)物在一定器官或組織積累，執(zhí)行特

27、定的功能，同時(shí)避免了植物營(yíng)養(yǎng)的不必要浪費(fèi)。,作為植物基因工程最有前景的調(diào)控元件，組織特異性啟動(dòng)子成為近年研究的熱點(diǎn)。,環(huán)境因素誘導(dǎo)表達(dá)基因： 在長(zhǎng)期適應(yīng)和進(jìn)化過(guò)程中，植物形成了感知環(huán)境并能做出適應(yīng)性反應(yīng)的特性。主要是通過(guò)啟動(dòng)不同基因的表達(dá)可在一定范圍內(nèi)適應(yīng)光、溫、水等環(huán)境的變化。,環(huán)境因素誘導(dǎo)表達(dá)基因是在某些特定的物理或化學(xué)信號(hào)的刺激下 ，通過(guò)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子活動(dòng)實(shí)現(xiàn)的。天然誘導(dǎo)型啟動(dòng)子包括光、溫度、激素應(yīng)答啟動(dòng)子等。,目前已經(jīng)分離了光誘導(dǎo)表達(dá)基因啟動(dòng)子、熱誘導(dǎo)表達(dá)基因啟動(dòng)子、創(chuàng)傷誘導(dǎo)表達(dá)基因啟動(dòng)子、真菌誘導(dǎo)表達(dá)基因啟動(dòng)子和共生細(xì)菌誘導(dǎo)表達(dá)基因啟動(dòng)子等。,確定某種基因在何種組織專(zhuān)一表達(dá)的方法：,

28、以基因編碼區(qū)中一段序列為探針，從不同組織或器官中提取總 mRNA，進(jìn)行Northern雜交。,Northern 雜交技術(shù)用于檢測(cè)特異性 mRNA 的存在。mRNA 樣品經(jīng)電泳分離后，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，與 DNA 探針進(jìn)行雜交，即可檢測(cè)特異性mRNA分子在樣品中存在與否，量的多少。,mRNA,mRNA,電 泳,DNA probe,轉(zhuǎn) 膜,Northern 雜交技術(shù)廣泛用于研究特異性mRNA分子在細(xì)胞處于不同條件下發(fā)生量和質(zhì)的變化，或不同組織器官中基因表達(dá)的差異。, Northern 原位雜交,指在細(xì)胞、組織切片上直接進(jìn)行分子雜交，通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)特異 mRNA 的存在與否來(lái)了解哪些細(xì)胞中有特異

29、基因的表達(dá)。,整個(gè)過(guò)程包括材料的預(yù)處理、細(xì)胞固定、細(xì)胞的 DNase 酶解（降解DNA，減少非特異性雜交）雜交、檢出。, 將待測(cè)基因的啟動(dòng)子序列與一報(bào)告基因的編碼區(qū)及 3 端終止區(qū)連接，建成融合基因，經(jīng)轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞得到再生植株后，檢測(cè)報(bào)告基因在何種組織與細(xì)胞中表達(dá)。 常用的報(bào)告基因有：GUS基因、 Nos、Ocs 基因等。,葡萄糖苷酸酶； X-Glucuionic acid （5-bromo-4-chloro-3-indoylglucuronic acid）,GFP,蕎麥細(xì)胞色素的可溶區(qū)段（紅色）, 用基因編碼的蛋白質(zhì)制備出抗體，對(duì)植物不同組織切片進(jìn)行免疫原位雜交。（ Western蛋白質(zhì)雜交

30、技術(shù)),4.1 器官、組織專(zhuān)一性表達(dá)的基因, HRGP 基因： 編碼富含羥脯氨酸糖蛋白( Hydroxyproline-rich glycoprotein HRGP )，主要在莖柵狀細(xì)胞、表皮細(xì)胞中表達(dá)。, rbcS 基因： 編碼 Rubisco 小亞基，在葉肉細(xì)胞、保衛(wèi)細(xì)胞、中脈與綠色組織細(xì)胞中表達(dá)。, P2基因： 編碼一種參與花粉管萌發(fā)生長(zhǎng)的蛋白質(zhì)，只在雄蕊成熟花粉與花粉管中表達(dá)。 PAL2基因： 編碼PAL，參與花色素形成，只在花瓣中表達(dá)。, Gy4基因： 編碼大豆貯藏蛋白，只在胚乳組織中表達(dá)。 Amyl基因： 編碼-淀粉酶，種子萌發(fā)時(shí)，在糊粉層表達(dá)。,4.2 受環(huán)境影響而表達(dá)的基因,

31、HSP 基因： 編碼 8090、6575、1530kD 幾種熱激蛋白。 熱脅迫時(shí)，HSF單體在核內(nèi)組裝成三聚體，與DNA 的 HSE（熱激元件）結(jié)合，刺激HSP-mRNA轉(zhuǎn)錄，翻譯成HSP。HSP參與生物體內(nèi)新生肽的運(yùn)輸、折疊、組裝、定位以及變性蛋白的復(fù)性和降解。,HSP功能：維持變性蛋白質(zhì)的可溶性，使變性蛋白重新折疊成有活性的構(gòu)象，提高蛋白質(zhì)（酶）熱穩(wěn)定性。,熱激因子（HSF）循環(huán)激發(fā)熱激蛋白（HSP）mRNA的合成,雙子葉：20 單子葉：11,低溫誘導(dǎo)基因,低溫超量表達(dá)基因； 不包括低量、瞬時(shí) 表 達(dá) 基 因。,同工蛋白（isoform） 抗凍蛋白（antifreeze protein A

32、FP） 類(lèi)脂轉(zhuǎn)移蛋白（lipid transfer protein LTP） 胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白（LEA）, 低溫誘導(dǎo)基因： 植物經(jīng)低溫誘導(dǎo)能使某些特定的基因活化，表達(dá)合成一組新蛋白(Cold acclimation protein) 。,低 溫 誘 導(dǎo) 基 因,擬南芥中的冷調(diào)節(jié)蛋白 COR6.6、油菜的BN28 蛋白與魚(yú)類(lèi)抗凍蛋白有同源性，體外實(shí)驗(yàn)表明冷調(diào)節(jié)蛋白能減少凍融過(guò)程對(duì)類(lèi)囊體膜傷害。 擬南芥葉綠體的 CORl5 蛋白在體外能有效地防止乳酸脫氫酶因冰凍而失活，其效率較蔗糖高出106倍，較其它蛋白高102倍103倍 。,抗凍蛋白（AFP）: 一種能降低細(xì)胞間隙體液冰點(diǎn)的糖蛋白。, 水分

33、逆境誘導(dǎo)的基因：,水分脅迫會(huì)誘導(dǎo)一些特定的基因表達(dá)，合成新蛋白質(zhì)水分脅迫蛋白(water stress protein)。 這類(lèi)蛋白質(zhì)多數(shù)是高度親水的，能增強(qiáng)原生質(zhì)的水合度，起到抗脫水的作用。,水分脅迫蛋白的功能可能還包括對(duì)膜結(jié)構(gòu)的保護(hù)、恢復(fù)一些蛋白質(zhì)的活性和形成特定的水、離子通道 (如水孔蛋白)，改變或調(diào)節(jié)液泡和細(xì)胞質(zhì)中的s等。, 病菌感染誘導(dǎo)的基因： 病原物侵染能刺激植物致病相關(guān)基因表達(dá)，合成與正常組織不同的新蛋白，稱(chēng)為“病程相關(guān)蛋白”（PR）。 幾丁質(zhì)酶基因、葡聚糖酶基因、PAL基因 、CHS基因等。, 創(chuàng)傷誘導(dǎo)的基因： 植物受傷后一些基因往往被誘導(dǎo)表達(dá)，如土豆中的蛋白酶抑制劑II基因，

34、其表達(dá)產(chǎn)物抑制多種微生物和昆蟲(chóng)蛋白酶活性。,4.3 植物基因表達(dá)調(diào)控機(jī)理,（1）調(diào)控的特點(diǎn)（方式）： 染色質(zhì)水平的調(diào)控； 以正調(diào)節(jié)為主，具有多個(gè)調(diào)控序列； 調(diào)控區(qū)很大，遠(yuǎn)離啟動(dòng)子幾百至上千個(gè)bp； 存在多種轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控機(jī)制； 具有細(xì)胞特異性或組織特異性表達(dá)；,（2）順式作用元件與基因表達(dá)調(diào)控,植物基因的調(diào)控主要在轉(zhuǎn)錄水平上進(jìn)行，受特定順式作用元件（cis-acting element）和反式作用因子（trans-acting factor）影響。,基因轉(zhuǎn)錄所需的順式作用元件主要是： 啟動(dòng)子（ promoter ）和增強(qiáng)子（enhancer）；,啟動(dòng)子：,核心啟動(dòng)子(core promoter)

35、： 是決定轉(zhuǎn)錄起始位置的關(guān)鍵序列，也是普通轉(zhuǎn)錄因子TFD的結(jié)合位點(diǎn)。 TATA box： 位于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游 25 30bp。 起始子(initiator，Inr) ：是與轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)重疊的短的較保守序列,與基因轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)有關(guān)的一組DNA序列，位于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游 100 200bp以?xún)?nèi)，其功能是決定轉(zhuǎn)錄的起始位點(diǎn)和調(diào)控轉(zhuǎn)錄頻率。,上游啟動(dòng)子元件：（Upstream Promoter element，UPE） 位于較上游(30 110bp)，能較強(qiáng)影響轉(zhuǎn)錄起始的頻率，如 CAAT box 和 GC box。其中GC盒是轉(zhuǎn)錄因子 SPl 的結(jié)合位點(diǎn)。,組成型啟動(dòng)子(constitutive prom

36、oter)： 是指在該類(lèi)啟動(dòng)子控制下，結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)大體恒定在一定水平上，在不同組織、部位表達(dá)水平?jīng)]有明顯差異。 花椰菜花葉病毒（CaMV）35S 啟動(dòng)子； 胭脂堿合成酶基因Nos 啟動(dòng)子（具有植物啟動(dòng)子特性）,啟動(dòng)子的分類(lèi)：,組織特異啟動(dòng)子(tissue-specific promoter)： 又稱(chēng)器官特異性啟動(dòng)子。在這類(lèi)啟動(dòng)子調(diào)控下，基因往往只在某些特定的器官或組織部位表達(dá)，并表現(xiàn)出發(fā)育調(diào)節(jié)的特性。,例如煙草的花粉絨氈層細(xì)胞中特異表達(dá)基因啟動(dòng)子TA29，豌豆的豆清蛋白（leguimin）基因啟動(dòng)子可在轉(zhuǎn)化植物種子中特異性表達(dá)，馬鈴薯塊莖儲(chǔ)藏蛋白（patatin）基因啟動(dòng)子在塊莖中優(yōu)勢(shì)表達(dá)。

37、,根特異啟動(dòng)子 ：根特異表達(dá)系統(tǒng)可用于研究轉(zhuǎn)基因植物的高滲脅迫耐受、植物修復(fù)和根際分泌等問(wèn)題。,莖特異啟動(dòng)子 ：莖中特異表達(dá)基因的啟動(dòng)子，不僅可從分子水平了解莖的發(fā)生、分化過(guò)程，更重要的是利用這些啟動(dòng)子調(diào) 節(jié)植物代謝可滿足人類(lèi)需求，如人們對(duì)木質(zhì)素生物合成及其調(diào)控的研究。,葉特異啟動(dòng)子 ： 花特異啟動(dòng)子： 果實(shí)、種子特異性啟動(dòng)子 ：,誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(inducible promoter)： 是指在某些特定的物理或化學(xué)信號(hào)的刺激下，該種類(lèi)型的啟動(dòng)子可以大幅度地提高基因的轉(zhuǎn)錄水平。 如、熱、創(chuàng)傷、真菌誘導(dǎo)表達(dá)基因啟動(dòng)子和共生細(xì)菌誘導(dǎo)表達(dá)基因啟動(dòng)子等。,天然誘導(dǎo)型啟動(dòng)子 包括光、溫度、激素應(yīng)答啟動(dòng)子等。

38、在進(jìn)化過(guò)程中，植物通過(guò)啟動(dòng)不同基因的表達(dá)可在一定范圍內(nèi)適應(yīng)光、溫、水等環(huán)境的變化。利用這些環(huán)境應(yīng)答基因的啟動(dòng)子與抗逆基因融合，從而使轉(zhuǎn)基因植物更好地適應(yīng)逆境。,人工構(gòu)建的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子 目前研究最多的是化學(xué)誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)。一個(gè)理想的化學(xué)誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)應(yīng)具備以下特點(diǎn)：,（1）外源基因在植物體自身不表達(dá)或低水平表達(dá)，當(dāng)添加誘導(dǎo)物后，高效誘導(dǎo)基因表達(dá)； （2）誘導(dǎo)物需要有較強(qiáng)的專(zhuān)一性； （3）誘導(dǎo)物可快速啟動(dòng)基因表達(dá)的“開(kāi)”與“關(guān)”；而且誘導(dǎo)物對(duì)植物無(wú)毒或低毒。, 增強(qiáng)效應(yīng)十分明顯； 可使基因轉(zhuǎn)錄頻率增加10100倍，有的可達(dá)上千倍；, 增強(qiáng)效應(yīng)與其位置和取向無(wú)關(guān)； 增強(qiáng)子提高同一條DNA鏈上基因轉(zhuǎn)錄效率

39、，可以遠(yuǎn)距離起作用，而且在基因的上游或下游都能起作用。 增強(qiáng)子的作用與其序列的正反方向無(wú)關(guān)，將增強(qiáng)子方向倒置依然能起作用。,增強(qiáng)子（enhancer）： 能顯著提高基因轉(zhuǎn)錄效率的一類(lèi)順式調(diào)控元件（其核心序列常為 812bp)，其作用特點(diǎn)：, 增強(qiáng)子沒(méi)有基因?qū)Ｒ恍裕?增強(qiáng)子要有啟動(dòng)子才能發(fā)揮作用，沒(méi)有啟動(dòng)子存在，增強(qiáng)子不能表現(xiàn)活性。但增強(qiáng)子對(duì)啟動(dòng)子沒(méi)有嚴(yán)格的專(zhuān)一性，同一增強(qiáng)子可以影響不同類(lèi)型啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄。,當(dāng)增強(qiáng)子移位時(shí)，能提高新位置周?chē)虻霓D(zhuǎn)錄。使某些癌基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)增強(qiáng)，可能是腫瘤發(fā)生的因素之一。, 增強(qiáng)效應(yīng)有組織和細(xì)胞專(zhuān)一性； 增強(qiáng)子必須與特定的蛋白質(zhì)因子結(jié)合后才能發(fā)揮增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄的作用。增強(qiáng)子一般具有組織或細(xì)胞特異性，許多增強(qiáng)子只在某些細(xì)胞或組織中表現(xiàn)活性，是由這些細(xì)胞或組織中具有特異性蛋白質(zhì)因子所決定的。, 許多增強(qiáng)子還受外部信號(hào)的調(diào)控； 如熱激蛋白基因的表達(dá)。金屬硫蛋白基因上游增強(qiáng)子能對(duì)環(huán)境中的鋅濃度做出反應(yīng)。,應(yīng)答元件(responsive elements) 真核細(xì)胞中對(duì)某些特定的環(huán)境作出應(yīng)答的基因，常具有相同的順式元件應(yīng)答元件。RNA Pol的誘導(dǎo)型轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合部位。,沉寂子(silencer)： 負(fù)調(diào)控元件是能抑