1、丙型肝炎進展,中山醫(yī)院消化內科 張順財,l HCV是非甲非乙型肝炎的主要病因 l起病隱匿，臨床表現輕微，常導致慢性肝炎。 l全球約1.7億人感染過HCV l1%2%的美國人有HCV感染 l我國乙型肝炎仍占大多數 l HBV重疊HCV感染的臨床表現及病理改變更 加嚴重,概述,HCV的發(fā)現,l 70年代中期發(fā)現為非甲非乙型肝炎 l 約2/3輸血后肝炎是由非甲非乙型肝炎病毒所致 l 1978黑猩猩非甲非乙型肝炎模型確定是由病毒 引起 l 病毒生物學分子特性與黃病毒相似，后被命名 為HCV,HCV基因結構,5NC 3010-3033aa 3NC,341nt,衣殼 高變區(qū) 包膜 疏水膜 解旋酶 疏水 膜

2、蛋白 RNA多聚酶 蛋白 蛋白 蛋白,HCV基因結構模擬圖,l 3NCR-高度變異、Poly(u)、Poly(u/c)及98個 堿基高度保守區(qū)組成 l 5NCR-340核苷酸組成，形成一個環(huán)柄桿結 構(stem-loop) l兩端中間為開放讀框(ORF)-9000個核苷酸 l E1編碼的糖蛋白可能不是單一蛋白，而有二 種或更多 l 3端的ORF編碼的非結構蛋白，至少包括6種 蛋白，包括蛋白酶、解旋酶、多種RNA聚合 酶及調節(jié)肽等 l 4a基因產生的調節(jié)肽具有多種功能,HCV基因結構的異質性,E1區(qū)域，又稱第一高變區(qū)(Hypervariable region ,HVR1)90nt 有些病毒存在著

3、第二高變區(qū)(HVR2)，即在E2/NS1區(qū)域近3-末端處21nt,基因型(Genotype),Okamoto-1,2,3,4型 Enomoto-PT,K1,K2a,K2b型 Simmonods-1a,1b,2a,2b型,l HCV至少存在6個基因型 l HCV亞型已超過50個，最常見的為1a,1b,2a,2b亞型1,2,3 型及其亞型分布世界各地： 4型主要分布在非洲，是扎伊爾及埃及的主要基因型 l 5型是南非的主要基因型 l 6型及其亞型主要發(fā)現在亞洲,HCV慢性感染與體液免疫,HCV不能誘導保護性免疫 HCV感染后恢復期的黑猩猩不能防止8種同種或異種HCV再感染 HCV慢性感染的人或黑猩猩

4、可多次發(fā)生急性丙肝或異種HCV重疊感染,HCV誘導的持續(xù)慢性的機理,宿主因素，如不能誘發(fā)保護性免疫 病毒因素，如病毒變異 與HCV-RNA整和到宿主基因無關 HCV誘導的宿主細胞及體液免疫反應不能預防及清除HCV感染,HCV準基因株(Quacispecies),大多數RNA病毒在復制過程中，易出錯 在同一個體內很難找到完全相同的RNA基因 基因之間關系甚密，這就是所謂準基因株 病毒準基因圍繞主要基因，數量以主要基因為主 感染某一時期，各基因的分布狀態(tài)代表宿主與病毒之間的最佳狀態(tài) 主要基因起主要地位，是由于主要基因復制率較高之故 免疫靶基因不單是主要基因，而是基因的復合體,RNA病毒基因變異生物

5、學作用,免疫逃避作用，導致病毒的持續(xù)感染 耐藥病毒株的產生 疫苗失敗 減毒活疫苗恢復致病性等 HCV-RNA基因復雜程度與相關肝病進展有密切關系 準基因越復雜，干擾素療效也越差,HCV準基因株與宿主免疫反應,宿主體液及細胞免疫壓力 病毒復制出錯 HCV基因變異 逃避宿主免疫系統(tǒng)攻擊作用 HCV持續(xù)感染,HCV準基因株與宿主免疫反應,產生中和抗體 中和抗體清除病毒的能力極有限 對所分離的病毒有作用 對準基因復合體無效 HCV中和抗體主要作用部位在HVR1區(qū) HVR1基因的變化是體液免疫作用的結果 最近又發(fā)現E2保守區(qū)（HVR1外區(qū)域）分離到中和抗體,丙型肝炎實驗室診斷,HCV抗體測定 HCV抗體

6、測定的其他試驗 分子生物學的檢測 定性試驗：檢測血清中是否有HCV-RNA的存在 定量HCV-RNA測定：估計患者血清中HCV-RNA含量 HCV-RNA基因分型：確定HCV-RNA基因性質 組織培養(yǎng)分離出的病原體對診斷非常有用,篩選試驗HCV抗體測定,第一代HCV抗體 抗體檢測用酶免疫測定法（EIA）-優(yōu)點多，方便、重復性好、成本低 EIA-1是用HCV-NS4基因段重組抗原，命名為C100-3-敏感性及特異性均不理想 僅80%患者HCV抗體陽性 假陽性很高,篩選試驗HCV抗體測定,第二代HCV抗體 EIA-2(1992)試驗含有NS4、核心及NS3基因抗原-代表了多種抗原 敏感性及特異性有

7、改善 HCV血清陽轉平均窗口期（window periods）明顯縮短 血清陽轉的平均時間 EIA-周左右 EIA-1-16周 陽性率為95%,篩選試驗HCV抗體測定,第三代HCV抗體測定 EIA-3含有重建核心和NS3抗原及NS5抗原 敏感性有增加(97%) 血清陽轉時間為2-3周,HCV抗體測定的其他試驗,第二代RIBA-抗HCV補充性試驗 內含抗原與EIA-2相同 但以免疫印跡形式 結果可解釋為陽性、可疑及陰性 高危人群中的抗HCV陽性標本，沒有必要行補充試驗 第三代補充試驗（RIBA-3）其特異性更好,HCV-RNA定性試驗,逆轉錄PCR RT-PCR方法各家不一，缺乏標準化 有許多因

8、素影響著PCR方法，如標本處理及儲存形式，引物設計、擴增倍數、反應條件、DNA產物的污染、擴增后產物檢測系統(tǒng)等 嚴格的質控、操作人員的熟練程度尤為重要 藥盒并不能完全保證結果的可靠性,HCV-RNA定量試驗,估價血清中HCV-RNA水平 反映感染機體的病毒復制率及清除率 在未治療的慢性丙肝機體內病毒負荷相對穩(wěn)定 目前有二種方法可定量HCV-RNA水平，即靶擴增技術如定量PCR方法及信號擴增技術如支鏈DNA法,HCV基因型測定,檢測基因型方法一般分為二類 ： 檢測HCV基因的點突變的篩選試驗 評估HCV基因更大片段的驗證性試驗 HCV基因型的篩選試驗有 ： (1)對HCV高度保守的5-NC區(qū)域行

9、限制性片段長度多 型性分析（RFLP） (2)對HCV-5NC區(qū)域行逆轉錄斑點雜交分析，又名 LIPA方法 (3)用型特異的引物對HCV核心基因巢式PCR。在臨 床應用中RFLP與LIPA差異較小。 (4)病毒蛋白抗原性分型 評估HCV基因更大片段的驗證性試驗-序列分析,丙肝的臨床診斷,抗HCV（EIA-2）+ 確診 RIBA-2 PCR 肝穿 陰性 可疑 陽性 陽性 陰性 排除 PCR 肝穿 隨訪 排除,肝病嚴重程度的評估,肝活檢-黃金標準 ALT水平-不能反映肝病的嚴重程度 血清HCV-RNA水平-不能評價肝病的嚴重程度 HCV基因型-HCV-1b型與嚴重肝病之間無關系,肝活檢在丙肝中的作

10、用,適應癥 : (1) 持續(xù)性或間歇性ALT異常6月 (2) 疑有其他肝病如酒精性、脂肪肝或血色病等 禁忌癥： (1)凝血功能嚴重異常 (2)終末期肝病 肝活檢的不利因素 : (1) 產生并發(fā)癥 (2) 患者拒絕 (3) 費用,肝炎活動度的評價,丙肝的組織學特征 : 脂肪變性 淋巴細胞浸潤或淋巴濾泡形成 膽管損傷 非絕對，偶出現在慢乙肝或自體免疫性肝病中 所有報道的特征性改變有所差異,Knodell肝組織評分,半定量方法 ,包括4個特征 : 匯管區(qū)周圍壞死（碎屑壞死）伴有或不伴有 橋樣壞死 肝實質細胞損傷 匯管區(qū)炎癥 纖維化 評價肝炎癥及纖維化的分級和分期系統(tǒng) 即（G0-G4）（S0-S4）

11、Knodell積分常用來排除主觀因素，但在實際應用 中并不能完全排除,肝活檢的重要性,是評價慢性丙肝自然史 為治療方案的選擇提供依據 預示干擾素治療的反應率 決定何時開始、推遲或終止治療 如果知道HCV感染時間，肝穿刺結果則可 推知其肝病進展概率 有助于證實其他肝病 ，如酒精性、非酒精性脂肪肝或血色病等以便適當治療,丙肝治療后肝活檢,目前仍沒有統(tǒng)一意見。因此，除非特別需要（如第二次治療開始），一般不作常規(guī)治療后肝穿刺,ALT、HCV-RNA與肝組織學關系,ALT異常者肯定有慢性肝病的存在，但ALT正常者不能保證肝組織正常 ALT水平不能預示肝病嚴重程度 ALT水平不能預示肝組織內匯管區(qū)浸潤、淋

12、巴濾泡形成、膽管損傷及脂肪變性程度 HCV-RNA水平與肝組織學改變之間無相關，不能預示肝病程度的嚴重性 關于血液檢查各參數缺乏與肝組織相關的機理仍不清楚 ：肝組織學改變的形成是動態(tài)因素與靜態(tài)因素綜合之結果 ，而外周血參數的檢測，只反應檢測當時的情況 。,丙型肝炎與肝細胞癌,HCV相關HCC流行病學,HCV相關HCC主要發(fā)生在HCC發(fā)生率為中等的地區(qū)，如北歐及日本 在HCC發(fā)生率較高地區(qū)，HCC仍以HBV感染為主 在意大利、西班牙及日本，約50-75%的HCC與HCV感染有關 少數北歐國家如希臘，抗HCV陽性的HCC不到20% 美國各地區(qū)差異很大 來自南佛羅里達洲一份報告，50%以上的HCC中

13、抗HCV陽性，許多患者為拉丁美洲人 來自Alaska報告，僅極少數HCC中可查到抗HCV，HCC的主要原因仍為HBV感染 Baltimore研究報道，約16%HCC患者抗HCV陽性，并且大多數患者HCV-RNA陽性 los Angelos的非亞洲的HCC患者約33%抗HCV陽性,HCV引起HCC的機理,確切機理仍不清楚 HCV核心蛋白在體外具有某些直接致癌作用 ： 能使鼠胚胎纖維母細胞轉化為惡性細胞 具有抑制凋亡作用 HCV基因型對HCC的作用不一 HCV相關HCC的發(fā)生與肝硬化有關 在各種原因所致的肝硬化中，其致HCC的危險性不一,HCV相關其他危險因素,HBV與HCV同時感染：發(fā)生HCC的

14、相對危險為82.5，而單純HCV感染其相對危險性僅為6.6 飲酒：加劇慢性丙肝過程，加速發(fā)展成肝硬化，酒精可增加循環(huán)中HCV-RNA含量 卟啉病,臨床表現,HBV相關HCC發(fā)病較HCV相關HCC為年輕 HBV相關HCC中常伴有肝硬化，而HCV相關HCC中幾乎所有病例合并肝硬化 HBV相關HCC其癌腫常為單個，而HCV-HCC則開始就為多中心,HCC發(fā)生率,如果60%HCV感染患者發(fā)生慢性肝炎，其中20%患者在10年內發(fā)生肝硬化，則HCV感染患者的12%將發(fā)生肝硬化。 如估計HCC每年發(fā)生的危險性為1-4%，則20年后，約1.2-4%的HCV感染者將發(fā)生HCC，而1.9-6.7%得慢性肝炎及9.

15、6-33.5%的肝硬化患者將發(fā)生HCC。,丙型肝炎的治療,干擾素治療,具有抗病毒、抗纖維化及免疫調節(jié)作用 抗HCV的確切機理仍不清楚 目前常用的有四種-干擾素，即-2a、-2b、-nI及-C 其他類型干擾素尚待進一步評價,-干擾素,-2b干擾素是用人白細胞-2b基因通過重組DNA技術產生而成 -2a干擾素也是人白細胞基因經重組DNA技術產生，但其基因結構與-2b只相差一個氨基酸 -nI干擾素是人淋巴母細胞產生的9個干擾素亞型的復合物 -C干擾素(a-consensus interferon)是通過篩選各種干擾素亞型，保留其相同的氨基酸，形成一致的分子結構，然后根據此序列合成DNA，再進行克隆產

16、生,干擾素應用對象,HCV抗體陽性或HCV-RNA陽性的慢性肝炎患者 ALT升高在正常上限的1.5倍以上 無嚴重其他并發(fā)癥及精神異常 治療前一年內曾行肝穿刺檢查,治療效果的標志,ALT被認為是一種理想的反應被定義為治療結束后ALT正常持續(xù)在6個月以上 HCV-RNA消失也作為一個有效反應的指標,治療反應,一般以三個時期來評價 ： 治療過程中 治療結束后 隨訪過程中,干擾素治療的結局,無反應（無效）：ALT或HBV-DNA或 HCV-RNA 6月內沒有降致正?；蛳?部分反應： ALT或HBV-DNA或HCV-RNA 治療后有下降但沒有至正常范圍或停藥后各 指標又出現異常 完全反應（有效）： A

17、LT或HBV-DNA或 HCV-RNA 治療后正?；蛳?，停藥后6個 月內仍正常 復發(fā)：完全反應患者以后又始出現各指標異常,在治療過程中可發(fā)生另外兩種情況 ： 突破(breakthrough)，開始ALT降至正常 或HCV-RNA消失，而后ALT又開始 升高 或HCV-RNA轉陽。 ALT水平在治療中始終不正常 復發(fā)是治療過程中ALT正?；騂CV-RNA轉陰，停藥后ALT升高或HCV-RNA轉陽 組織學上的改變對干擾素治療效果的評定也是相當重要的,另外情況即 1)治療結束后ALT接近正常，然后降至正常，這些患者按定義為無反應者，但其很可能有病毒學上的反應 2)有些患者為完全反應，但其HCV-R

18、NA不消失，這些患者按定義為反應者，但很有可能復發(fā)。有些患者為部分反應，即ALT水平降低，但不正常，組織學有改善，血清病毒不消失等,首次治療的反應率,以6個月為一療程的治療中,一般認為，治療末反應率(ETR)為35%50%，持續(xù)反應率(SR)為8%21%，病毒ETR為27%35%，SR為8%12% 以12月為一療程中，ETR與6月療法無差異，但其復發(fā)率明顯減少，SR為19%42%，2倍于6月療法 近年來對干擾素治療隨機研究進行Meta分析認為首次治療的最佳方案為3Mu，3/w12月,肝硬化患者干擾素資料,約20%30%HCV感染人群進展成肝硬化 肝硬化患者應用干擾素其反應率明顯低于慢性肝炎 常

19、規(guī)劑量干擾素在肝硬化中副作用明顯增加 26個研究結果 1315患者 ALT復常率 HCV-RNA消除率 肝硬化占434(31%) 27% 5%10% 慢性肝炎884(67%) 53% 20%35%,ALT正常的慢性肝炎干擾素治療,一般認為ALT異常的慢性丙肝列入干擾素治療，但對ALT正常的慢性丙肝是否應用干 擾素治療尚不清楚,干擾素再治療,對無反應患者再治療 13組報道共591例無反應患者再接受不同類型-干擾素治療 ETR SR 3Mu6月 5% 0% 3Mu6月 13% 3% 6月 11% 2%,干擾素再治療,復發(fā)患者的再治療 1）復發(fā)患者再治療的ETR為77%87% 2）SR分別為15%、

20、29%及43% 3）3Mu6u6月治療與3Mu或/和6月療 效相差不大 4）一般認為復發(fā)的再治療有益，以 3Mu12月為佳,急性丙型肝炎,急性丙肝的早期發(fā)現，及時治療有防止慢性丙肝發(fā)生的作用,兒童丙肝,兒童丙肝對干擾素反應率與成人相似,但令人擔心的干擾素副作用如發(fā)育延遲(retardation)等,其他 ： 免疫抑制治療的丙肝患者，如腎移植、肝移植患者 1）有導致臟器排斥的可能 2）一般采用低劑量治療或加用其他抗病毒藥物 伴有自身免疫性肝病的慢性丙肝治療 1）如采用干擾素治療可使自身免疫性肝炎加劇 2）在此應使用免疫抑制劑治療 伴有精神癥狀的丙肝患者一般不用干擾素治療,利巴韋林(Ribavir

21、in),利巴韋林是口服鳥苷類似物 沒有誘生干擾素的作用 能抑制RNA和DNA病毒復制 對HCV感染的治療有一定作用 1. 使ALT正常 2. 組織學改善，炎癥好轉 3. 約30%40%患者有反應,干擾素與利巴韋林聯合應用,干擾素a-2b3MuTiw6月及利巴韋林1000mg/日624月，平均18月，結果：治療6月時，100%患者ALT正常，60%HCV-RNA消失，另外5例HCV-RNA水平有下降。隨訪17月后，除1例ALT異常外，其余病例ALT均保持正常，并且組織學上有改善，沒有1例發(fā)生肝排斥反應及膽管消失。以上結果提示二藥聯合應用對肝移植后丙肝治療有良好的前景。,派羅欣PEG-INTEFE

22、RON2a,聚乙二醇化（PEG)干擾素的特點,PEG = Polyethylene Glycol polymers 惰性，無毒, 水溶性 Pegylation（聚乙二醇化）將聚乙二醇與干擾素共價結合在一起，改善其生物活性 PEG與水分子結合，體積增大，形成保護“屏障” 阻止蛋白酶降解 防止腎小球濾過 減少免疫原性,第二代PEG干擾素：真正的一周干擾素,0,25,50,75,150,時間（小時）,0,25,50,75,100,125,150,0,0,8,12,普通干擾素,Interferon-a (U/mL),4,125,100,小分子線性PEG干擾素,168,12 kDa PEG-IFN (n

23、g/mL),0.5,1.0,1.5,Mo Tu We Th Fr Sa Su,Mo Tu We Th Fr Sa Su,20 15 10 5 0,分支狀大分子PEG干擾素（40KD) 派羅欣,40 kDa PEG-IFN (ng/mL),0 25 50 75 100 125 150 168,時間（小時）,時間（小時）,17,長效干擾素(Pegasys),聚乙二醇化 聚乙二醇分子在干擾素分子外面形成一個分子屏障，降低其免疫原性，保護其免受酶的分解 體內滯留時間長 聚乙二醇干擾素吸收入血后，代謝速度緩慢，半衰期為40100 h，在用藥168h后，仍能維持較高的血濃度，可以每周1次給藥 代謝途徑 聚

24、乙二醇干擾素30經腎臟代謝、其余大部分或與干擾素受體結合，或經肝臟的非特異性代謝而排出。,聚乙二醇化技術可以克服傳統(tǒng)干擾素IFN 的缺陷 聚乙二醇化IFN-2a (40KD) (派羅欣) 治療HCV感染的療效顯著優(yōu)于傳統(tǒng)IFN,新的HCV治療藥物 派羅欣,鐵負荷減少對HCV的影響,鐵對肝組織損傷作用及加重肝炎的機理,非特異性作用 1) 增加氧化作用 2) 增加脂質過氧化作用 3) 耗盡肝細胞保護因子及巰基 4） 加劇免疫介導炎癥反應 對病毒作用 1) 加速病毒復制 2） 加速病毒變異,對宿主免疫作用 1) 損害鐵負荷抗原呈遞細胞功能 2) 損害細胞免疫 a. 抑制Th1和細胞毒T淋巴細胞克隆效

25、能 b. 阻止T淋巴細胞增生及成熟 c. 損害炎癥前細胞反應(proinflammation cell) d. 損害殺傷細胞依賴的感染細胞溶解作用 3) 體液免疫：損害血漿抗體和補體依賴 調理素活性作用,鐵負荷減少對丙肝的治療作用,靜脈切開放血術，能使丙肝患者ALT水平降至正常 聯合應用的療效優(yōu)于單用干擾素治療 但對HCV-RNA變化的研究尚無報道 38例丙肝隨機分二組 N ETR SR 干擾素 21 29% 5% 聯合組 17 59% 29% 減少鐵負荷包括：靜脈放血術及使用鐵螯合物，,細胞因子及免疫調節(jié)劑,GM-CSF及左旋咪唑與干擾素聯合應用，不提高干擾素的反應率，相反增加其副作用 胸腺素-1，是一短肽(28氨基酸)，來源于胸腺，具有免疫調節(jié)作用 胸腺肽(thymosin)是有效的免疫調節(jié)劑，與干擾素聯合應用對丙肝治療有益,抗氧化劑及巰基供體,其他藥物,對丙肝治療良好反應的預示因素,常規(guī)反應定義 ETR為治療結束后血清ALT水平降至正常以下 SR為治療結