PAGEPAGE10生物工程實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)（試用版）（適用于生物科學(xué)和生物技術(shù)專業(yè)）主編高國輝副主編李勁松周曉輝溫州醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)院2010年1月目錄基因工程學(xué)實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)一重組原核表達(dá)載體的構(gòu)建與克隆鑒定………………1實(shí)驗(yàn)二重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)…………………9實(shí)驗(yàn)三重組蛋白的聚丙烯凝膠電泳（PAGE）…………………12實(shí)驗(yàn)四重組蛋白純化：可溶性HisTag-蛋白的抽提…………16實(shí)驗(yàn)五蛋白質(zhì)免疫印跡分析（WesternBlot）………………19微生物工程學(xué)實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)一種子、發(fā)酵培養(yǎng)基制備及培養(yǎng)基實(shí)消…………………22實(shí)驗(yàn)二發(fā)酵種子擴(kuò)大培養(yǎng)、一級(jí)種子制備……24實(shí)驗(yàn)三接種與發(fā)酵過程控制管理…………………25實(shí)驗(yàn)四發(fā)酵液SOD活性檢測(cè)……………………27生化工程學(xué)實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)一超氧化物歧化酶粗酶液的分離純化………28實(shí)驗(yàn)二超氧化物歧化酶蛋白濃度和酶活性的測(cè)定………………30實(shí)驗(yàn)三超氧化物歧化酶活性染色鑒定法…………33實(shí)驗(yàn)一重組原核表達(dá)載體的構(gòu)建與克隆鑒定一、實(shí)驗(yàn)原理重組表達(dá)載體的構(gòu)建是基因工程實(shí)驗(yàn)的第一步，也是目的蛋白進(jìn)行表達(dá)的基礎(chǔ)，其關(guān)鍵技術(shù)為DNA體外重組，即應(yīng)用酶學(xué)方法，將需表達(dá)的基因片段在體外進(jìn)行特異性切割，與合適的表達(dá)載體分子重新連接，組裝成一個(gè)新的重組表達(dá)載體質(zhì)粒。表達(dá)載體在基因工程中扮演首十分重要的角色，負(fù)責(zé)克隆目的的基因、指導(dǎo)目的基因在宿主體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄和翻譯，表達(dá)載體內(nèi)有3個(gè)系統(tǒng)完成以上3種功能。（1）DNA復(fù)制及質(zhì)料DNA的篩選。這一系統(tǒng)與普通的克隆質(zhì)料一樣，由DNA復(fù)制起始位點(diǎn)ori和抗藥性基因（如氨芐青霉素抗性基因Amp、四環(huán)素抗性基因Tet等）來完成，松馳型ori位點(diǎn)能使載體借用宿主的DNA復(fù)制體系大量復(fù)制載體DNA，同時(shí)克隆的目的基因亦得以大量復(fù)制，為基因的高水平轉(zhuǎn)錄提供足夠多的模板，如載體還裝配有其它生物的ori，則可在不同生物宿主中進(jìn)行載體DNA復(fù)制，這類載體稱為穿梭載體，截體上的抗藥性基因賦予宿主特定的抗藥性，使其能在有抗生素的培養(yǎng)條件下正常生長，這樣就篩除掉不含載體的宿主，同時(shí)保證載體在宿主中的穩(wěn)定存在。（2）目的基因的轉(zhuǎn)錄，這一系統(tǒng)包含啟動(dòng)子、抑制物基因和轉(zhuǎn)錄終止子，啟動(dòng)子是一個(gè)段能被宿主RNA聚合酶特異性性識(shí)別和結(jié)合并指導(dǎo)宿主轉(zhuǎn)錄目的基因的DNA順序，位于目的基因的上游，表達(dá)載體選用在宿主中起始功能強(qiáng)的強(qiáng)啟動(dòng)子（如原核的Lac,Trp,T7等啟動(dòng)子），目的基因在這類啟動(dòng)子的指導(dǎo)下轉(zhuǎn)錄出大量的mRNA，為后一步的蛋白質(zhì)翻譯提供盡可能多的模板，抑制物基因產(chǎn)物對(duì)啟動(dòng)子起始功能產(chǎn)生抑制，適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)條件可使抑制物失活，啟動(dòng)子功能置新恢復(fù)，是一種控制啟動(dòng)子功能的蛋白質(zhì)，通過它使目的基因在宿主培養(yǎng)到最佳狀態(tài)時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，保證轉(zhuǎn)錄有效進(jìn)行，特別是表達(dá)產(chǎn)物對(duì)宿主害時(shí)，控制轉(zhuǎn)錄時(shí)機(jī)尤其置要；轉(zhuǎn)錄終止于是一段終止RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄的DNA順序，使轉(zhuǎn)錄在目的基因之后立刻停止、避免作多余的轉(zhuǎn)錄以節(jié)省宿主內(nèi)RNA的合成底物，提高目的基因的轉(zhuǎn)錄量，啟動(dòng)子和終止子因宿主的不同而有差別，往往在不同的物種宿主中表達(dá)的效率也不一樣、特別是原核生物和真核生物宿主間期完全不同，相互不能通用，這一點(diǎn)應(yīng)特別注意。（3）蛋白質(zhì)的翻譯，這一系統(tǒng)包含核糖體識(shí)別位點(diǎn)（如原核的SD順序）翻譯起始密碼子和終止密碼子。SD順序與原核宿主核糖休16srRNA特異配對(duì)而結(jié)合，大腸桿菌SD順序的成基組成為AGGA，mRNA翻譯模板與核糖休的親和力高低對(duì)翻譯效率極重要，起始密碼子是翻譯的起始位點(diǎn)，通常為ATG，編碼Met（甲硫氨酸），也有極少數(shù)生物利用其他密碼子作為翻譯過程，這些位點(diǎn)可指導(dǎo)宿主的蛋白質(zhì)翻譯系統(tǒng)準(zhǔn)確高效地合成目的基因編碼蛋白質(zhì)，根據(jù)位點(diǎn)的構(gòu)造不同還可分為完整蛋白和融合蛋白表達(dá)載體：①完整蛋白表達(dá)載體：目的基因直接克隆進(jìn)其后，利用自身的起始密碼子表達(dá)編碼蛋白，有的載體其啟動(dòng)子后接有SD順序，另一些載體其啟動(dòng)子后沒有接SD順序，需要目的基因上游帶進(jìn)SD順序；②融合蛋白表達(dá)載體：載體啟動(dòng)子后連有SD順序和超始密碼子并表達(dá)另外一種多肽，目的基因按這個(gè)多肽的三聯(lián)密碼子閱讀框插進(jìn)多肽基因中的某一位點(diǎn)，表達(dá)出來產(chǎn)物為部分多肽與目的蛋白雜合的融合蛋白質(zhì)。轉(zhuǎn)錄出的mRNA5’上游的SD順序與ATG的間距長度和組成對(duì)目的基因的翻譯效率也很關(guān)鍵，間距以6-11個(gè)堿基，堿基組成CG比例不超過50%為最好。真核基因在原核生物中表達(dá)時(shí)，ATG以后的20-40個(gè)堿基組成也很重要，通過適當(dāng)?shù)腃G突變成AT的定點(diǎn)突變改造，有時(shí)可使表達(dá)效率提高幾倍甚至十倍以上，視基因不同和改造的位點(diǎn)不同而有不同的提高。二、試劑與材料1、菌種：大腸桿菌DH5α菌株（無抗生素抗性）或Topl0F+（四環(huán)素抗性）2、原核表達(dá)載體質(zhì)料：pET28（Ka‘）3、外源DNA片段：HBVS基因片段（bp）由PCR從病人血清中擴(kuò)增得到（引物為：LEFT5–CGAATTCATGGAGAGCACAACATCAGG-3RIGHT5–CAAGCTTAAATGTATACCCAAAGACAAA-3上下游分別引入EcoRI和HindIII酶切位點(diǎn)）PCR產(chǎn)物克隆入TA克隆。4、LB培養(yǎng)基每升液體LB培養(yǎng)基中含蛋白胨10克酵母浸出液5克NaCl10克NaOH調(diào)pH值至7.0-7.5每升固體LB培養(yǎng)基：加1.5%的瓊脂于液體之中。高壓蒸氣滅菌5、堿解法抽提質(zhì)粒之深液溶液I：50mM葡萄糖+25mMTris-HCI(pH8.0)+10mMEDTA，高壓蒸氣滅菌溶液II：0.2NNaOH+1%SDS溶液III：5MKAC，60ml冰乙酸，11.5ml水，28.5ml6、限制性內(nèi)切酶EcoRI和HindIII及10×酶切緩沖溶，-20℃7、膠回收用低熔點(diǎn)瓊脂糖凝或者華舜公司膠回收試劑盒8、T4連接酶或Takara公司快速連接酶試劑盒9、感受態(tài)細(xì)菌制備之溶液0.1%CaCl2溶液，4℃甘油，4℃10、其他試劑氨芐青霉素：貯存液100mg/ml，-20℃保存，工作濃度60-100ug/ml卡那霉素：貯存液50mg/ml，-20℃保存，工作濃度50ug/ml四環(huán)素：貯存液15mg/ml，-20℃避光保存，工作濃度15ug/mlTE緩沖液（pH8.0）10mMTris-HCI(pH8.0)+0.1mMEDTA,4℃3MNaAC（pH5.2）4℃無水乙醇11、電泳試劑電泳緩沖液TBE：5×母液，0.5×工作液溴化乙錠（EB）：10mg/ml1%agarose：1克agarose中加入100ml電泳緩沖液加熱溶解，然后加入5μg/ml。溴酚蘭指示劑：0.25%溴酚蘭+50%甘油12、器材細(xì)菌搖床、無菌試管、吸管、三角涂棒、50ml離心管、0.5ml和1.5微量離心管管、微量加樣器、高速臺(tái)式離心機(jī)、普通離心機(jī)、冰浴、干燥器、電泳儀、電泳槽、-40℃冰箱（菌種保存）等。三、操作1、堿裂解法小量制備細(xì)菌質(zhì)粒DNA（pTA/HBs以及pET28）（1）接種環(huán)挑取LB平板上的單個(gè)菌落，接種于2ml含相應(yīng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃，200rpm振搖培養(yǎng)過夜。（2）吸取1.5ml菌液于一微量離心管管中，10000g離心1min，倒掉培養(yǎng)液，使細(xì)菌沉淀盡量干燥。（3）加入100μl溶液I，旋渦振蕩器上充分振蕩，使沉淀懸浮。（4）加入200μl新鮮配制的溶液II，蓋緊蓋子，上下顛倒五次，冰上靜置5分鐘。（5）加入150μl溶液III，蓋緊蓋子、上下顛倒五次，冰上靜置5分鐘。（6）15000rpm離心5分鐘。上清轉(zhuǎn)移到另一微量離心管管中。（7）加入等量酚：氨仿（體積比1：1）抽提一次，15000離心5分鐘，將上清轉(zhuǎn)移到另一微量離心管中。（8）加入2倍體積的無水乙醇，冰上放置20分鐘，15000rpm離心10分鐘，小心傾去上清液。（9）用1ml70%乙醇洗滌DNA沉淀，15000rpm離心5分鐘，小心傾去上清液，在空氣中使核酸沉淀干燥15分鐘。（10）加30μl含Rnase（20ug/ml）的TE溶液（pH8.0）或ddH2O溶解DNA沉淀。（11）取2μl質(zhì)粒溶液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，檢查質(zhì)粒抽提結(jié)果。2、限制性內(nèi)切酶反應(yīng)（1）混合下列溶液于一個(gè)0.5ml的微量離心管中。10μl質(zhì)料DNA溶液（pTA/HBs或pET28）（100ng/μl）7μlddH2O2μl10×酶切反應(yīng)緩沖液0.5μl(10U/μl)EcoRI0.5μl(10U/μl)HindIII（總體積20μl）（2）37℃，溫育1小時(shí)3、低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠回收DNA片段及載體（1）DNA樣品用合適的限制性內(nèi)切酶完全消化，低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳，溴乙錠染色，然后用解剖切切下目的條帶（盡量?。?。（2）將凝膠塊于68℃熔化，估計(jì)融膠的體積，加入等休積的TE緩沖液（pH8.0）平衡酚，旋渦振蕩器上劇烈振蕩。（3）15000rpm離心5分鐘，依次可見酚相、瓊脂糖相和水相。小心吸取水相。（4）往剩下的酚、瓊脂糖相中加入與融膠等體積的水，1500rpm離心5分鐘，小心吸取水相。（5）合并兩次得到的水相，估計(jì)體積，加入1/10體積的3MNaAc溶液（pH5.2）。再用兩倍體積無水乙醇沉淀DNA（室溫放置30分鐘）。15000rpm離心15分鐘，小心吸去上清。（6）用200μl70%的乙醇洗滌沉淀一次，15000rpm離心5分鐘,小心棄去上清。（7）加入適量的ddH2O或TE緩沖液溶解DNA。注：如用華舜公司膠回收試劑盒回收，則按說明書進(jìn)行。4、連接反應(yīng)混合下列溶液于一個(gè)0.5ml的微量離心管中：1μl質(zhì)粒pET283μlHBVS基因片段1μl10×連接緩沖液1μlT4DNA連接酶（5U/μl）4μl水（總體積為10μl，16℃連接2小時(shí)）注：載體和片段的摩爾比為1：3.如用Takara公司快速連接酶試劑盒則按說明書進(jìn)行。5、感受態(tài)細(xì)菌的制備，要求無菌操作（1）接種大腸桿菌E.coliDH5α或Top10F+單一菌落于2mlLB培養(yǎng)基中，37℃振搖培養(yǎng)過夜。（2）吸取1ml的菌液，轉(zhuǎn)移到100mlLB培養(yǎng)基中，37℃振搖培養(yǎng)約3小時(shí)，使細(xì)菌處于對(duì)數(shù)生長期。（3）菌液放冰浴中冷卻10分鐘，然后將菌液分裝到2個(gè)預(yù)冷無菌的50ml離心管中。（4）4℃,4000rpm離心10分鐘，棄上清，細(xì)胞沉淀用10ml冰上預(yù)冷的0.1M的CaCl2溶液重新縣浮，冰上放置半小時(shí)。（5）5℃,4000rpm離心10分鐘，棄上清，細(xì)胞沉淀用2ml冰上預(yù)冷的0.1MCaCl2溶液重新懸浮，即得新鮮的感受態(tài)細(xì)胞。（6）如果凍存，加入預(yù)冷的甘油（15%體積），然后分裝到無菌預(yù)冷的微量離心管中，100μl/每管，凍存于-70℃。6、質(zhì)料DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α或Top10F+細(xì)胞。（1）于100μl感受態(tài)細(xì)胞（新鮮或凍存，凍存的感受細(xì)胞應(yīng)先置冰浴上融化）中加入5μl連接反應(yīng)產(chǎn)物，輕輕旋轉(zhuǎn)以混勻。（2）冰浴45分鐘，42℃熱擊90秒。（3）加入無抗生素的LB培養(yǎng)基900μl，37℃120rpm振蕩培養(yǎng)1小時(shí)。（4）6000rpm離心2分鐘，棄上清600μl。吸取200μl于LB平板（含相應(yīng)抗生素）上，用無菌三角涂棒涂布均勻，37℃培養(yǎng)12-16小時(shí)，平板上出現(xiàn)菌落，即為轉(zhuǎn)化體。7、重組質(zhì)料轉(zhuǎn)化體的酶切鑒定（1）用接種環(huán)從平板上挑取克隆，接種到2mlLB培養(yǎng)基中（含相應(yīng)抗生素），37℃振蕩培養(yǎng)12-16小時(shí)。（2）酶切鑒定：堿裂解法抽提質(zhì)料，用限制性內(nèi)切酶消化，瓊脂糖凝膠電脈查看酶切結(jié)果。如果有大小正確的片段切下，說明質(zhì)料pUC19中已插入HBVS基因片段。（3）PCR鑒定：隨機(jī)挑取轉(zhuǎn)化平板上數(shù)個(gè)菌落接種于微量孔板上（每孔加入含應(yīng)的抗生素的LB液100μl）37℃孵育3-4小時(shí)后進(jìn)行PCR。PCR反應(yīng)總體積30μl，含正、反向引物（25uM）各lul、10×Buffer3μl（含MgC121.5mM）、Taq酶0.3μl（1.5U）、10mMdNTPlul、菌液3μl，根據(jù)需要鑒定的片段大小設(shè)計(jì)PCR循環(huán)方式，進(jìn)行25-30個(gè)PCR循環(huán)后，取5μlPCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，判斷有無基因片段插入。（4）測(cè)序鑒定：將酶切鑒定或PCR鑒定得到陽性克隆進(jìn)行擴(kuò)增后，用“小量質(zhì)料抽提試劑盒”抽提質(zhì)料后送至公司測(cè)序，或直接送細(xì)菌樣品進(jìn)行測(cè)序。8、菌種的保存對(duì)獲得的陽性細(xì)菌必須進(jìn)行保存。將確證為陽性的細(xì)菌克隆進(jìn)行擴(kuò)增后取出約800-900ul的菌液加入甘油管中（甘油終濃度為15%），混勻后放置-40℃或-70℃保存。注意：1、在細(xì)菌接種、擴(kuò)增等過程中，LB液中必須加有對(duì)應(yīng)抗生素，否則細(xì)菌缺少這種壓力攜帶的質(zhì)?？截悤?huì)逐漸丟失，使得抽提的質(zhì)粒量少，難以進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。2、mRNA轉(zhuǎn)錄出來后，如果在SD序列或目的基因的ATG位點(diǎn)及附近出現(xiàn)有二級(jí)折疊結(jié)構(gòu)，并且其莖環(huán)中莖的長度大于5bp時(shí)，會(huì)嚴(yán)重影響到蛋白質(zhì)的翻譯效率，產(chǎn)率極低。通過定點(diǎn)突變或更換載體使這類二級(jí)結(jié)構(gòu)消除，可使表達(dá)效率提高10-100倍以上。PET28a-c原核表達(dá)載體圖譜實(shí)驗(yàn)二重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)一、實(shí)驗(yàn)原理最早建立并得到廣泛應(yīng)用的表達(dá)系統(tǒng)是以大腸桿菌lac操縱子調(diào)控機(jī)理為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)、構(gòu)建的表達(dá)系統(tǒng)，稱為Lac表達(dá)系統(tǒng)，lac操縱子是研究最為詳盡的大腸桿菌基因操縱子，該操縱子的轉(zhuǎn)錄受正調(diào)節(jié)因子CAP和負(fù)調(diào)節(jié)因子lacl的調(diào)控。在無誘導(dǎo)物情形下，lacl基因產(chǎn)物形成四聚體阻遇蛋白。與啟動(dòng)子下游的操縱基因緊密結(jié)合，阻止轉(zhuǎn)錄的起始，異丙基-α-βD-硫代半乳糖苷（IPTG）等乳糖類似物是lac操縱子的誘導(dǎo)物，它們與阻遇蛋白結(jié)合后使之改變構(gòu)象，導(dǎo)致與操縱基因的結(jié)合能力降低而解離出來，lac操縱子的轉(zhuǎn)錄因此被激活，由子lac操縱子具有這種可誘導(dǎo)調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的性質(zhì)，因此其元件和它們的一些突變體經(jīng)常被用于表達(dá)載體的構(gòu)建。如前圖所示，pET-28原核表達(dá)載體中則帶有l(wèi)acl基因，故可用IPTG進(jìn)行透導(dǎo)表達(dá)。表達(dá)載體、目的基因和宿主菌共同構(gòu)成一個(gè)完整的表達(dá)系統(tǒng)，因此良好的表達(dá)系統(tǒng)不僅與表達(dá)載體的目的基因有關(guān)，選擇合適的宿主菌也十分重要。首先表達(dá)載體的啟動(dòng)子應(yīng)在宿主中具有強(qiáng)起動(dòng)功效，不同的啟動(dòng)子對(duì)應(yīng)的宿主往往不同，如大場(chǎng)桿菌中的啟動(dòng)子選用大腸桿菌宿主，枯草桿菌啟動(dòng)子選用枯草桿菌宿主，這樣有利于充分發(fā)揮強(qiáng)啟動(dòng)子的效率；其次，某些表達(dá)載體自身不帶抑制藥基因，用這類載體就應(yīng)選擇能產(chǎn)生抑制物蛋白質(zhì)的宿主菌，否則表達(dá)不能調(diào)控，不利于高誑表達(dá)目的的基因，第三，表達(dá)的蛋白質(zhì)產(chǎn)物因宿主菌內(nèi)的蛋白酶作用會(huì)發(fā)生降解，所以許多用作表達(dá)的宿主都經(jīng)過改造，以便于表達(dá)蛋白的積累。當(dāng)表達(dá)的蛋白質(zhì)對(duì)宿主菌有毒害，應(yīng)考慮換一種宿主細(xì)胞，目前，我們對(duì)原核生物的了解要比對(duì)真核生物更全面更深入。當(dāng)前開發(fā)出的基因工程產(chǎn)品中80%-90%是用的原核生物表達(dá)系統(tǒng)。原核生物表達(dá)系統(tǒng)因基相關(guān)的基本理論和技術(shù)方法成熟、操作成本較低而得到廣泛的應(yīng)用。但是表達(dá)真核基因方面，因宿主缺少真核生物的蛋白質(zhì)加工系統(tǒng)（如剪切和糖基化）、基因的密碼子偏愛性不同及包含體復(fù)性等而受到限制。原核生物除大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)外，還有棒狀桿菌、枯草桿菌和沙門氏桿菌等表達(dá)系統(tǒng)，它們都有各自的優(yōu)缺點(diǎn)。二、試劑與材料1、表達(dá)菌株BL21DE3plysS感受態(tài)細(xì)胞2、pET28/HBs陽性克隆質(zhì)粒3、LB液體培養(yǎng)基（無抗性）4、LB液體培養(yǎng)基（kan+）5、LB平板（kan+）6、IPTG貯備液：2gIPTG溶于10mlddH2O，0.22μm濾膜過濾除菌，分裝成1ml/份，-20℃保存。工作濃度為1mM7、器材：細(xì)菌搖床、無菌試管、吸管、三角涂棒、50ml離心管、0.5ml和1.5ml微量離心管管、微量加樣器、高速臺(tái)式離心機(jī)、普通離心機(jī)、制冰機(jī)、-40℃冰箱（菌種保存）等。三、操作1、轉(zhuǎn)化取前面構(gòu)建的陽性質(zhì)粒10ng加入100ul表達(dá)細(xì)菌（BL21DE3plysS）感受態(tài)中，冰上放置45分鐘，在此過程中可以每隔幾分鐘用手輕彈Eppendof管，然后進(jìn)行熱休克（42℃水浴90秒，取出立即插入冰中放置5分鐘），加入預(yù)熱的無抗生素的LB液900ul、于37℃搖床中200rpm搖1小時(shí)，吸取50-100ul菌液進(jìn)行均勻涂板，LB平板必須含有相應(yīng)的抗生素，將LB平板放在37℃溫箱中過夜培養(yǎng)。2、誘導(dǎo)表達(dá)隨機(jī)挑取數(shù)個(gè)菌落，各加3ml含的LB液于37℃搖過夜，取出300ul菌液加3ml有抗生素的LB液，作1：10稀釋，37℃250rpm搖2小時(shí)（OD值約為0.2-0.6），于各管中加100mMIPTG30ul（終濃度為1mM），37℃250rpm搖6小時(shí)，進(jìn)行誘導(dǎo)。誘導(dǎo)后6000rpm離心2分鐘，收集菌體，用50ulddH2O重懸菌體，加等體積2×蛋白上樣液（約60ul），于沸水浴中變性5分鐘，同時(shí)取一個(gè)陰性對(duì)照（即未加IPTG誘導(dǎo)的菌體）經(jīng)過變性處理后同時(shí)進(jìn)行SDS分析，著有無目的的蛋白表達(dá)（下一次實(shí)驗(yàn)的內(nèi)容）。若須純化蛋白，最好選擇一表達(dá)量最大的菌種進(jìn)行以后實(shí)驗(yàn)。3、誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化對(duì)于不同的可溶性蛋白，進(jìn)行誘導(dǎo)的IPTG濃度、溫度、時(shí)間均不同，必須進(jìn)行選擇優(yōu)化，即在上述不同的條件下分別進(jìn)行誘導(dǎo)，通過SDS分析選擇最佳條件進(jìn)行蛋白誘導(dǎo)、表達(dá)和純化。注意：表達(dá)菌株的過夜培養(yǎng)物接種，是為了在誘導(dǎo)地培養(yǎng)基中的細(xì)菌能盡量處于同步生長狀態(tài)，以便于產(chǎn)物的大量表達(dá)，在按排實(shí)驗(yàn)時(shí)前一天應(yīng)考慮到將過夜菌接種培養(yǎng)，該實(shí)驗(yàn)的時(shí)間較長，第一次操作時(shí)，時(shí)間安排不當(dāng)，當(dāng)天可能做不完，而表達(dá)產(chǎn)物又不適合于過夜放置，應(yīng)當(dāng)予以注意。實(shí)驗(yàn)三重組蛋白的聚丙烯凝膠電泳（PAGE）一、實(shí)驗(yàn)原理聚丙烯酰胺凝膠電泳由丙烯酰胺單體和交聯(lián)劑甲又雙丙烯酰胺，在催化劑作用下，形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳具有很高的分辨率，這主要是由于濃縮膠的濃縮效應(yīng)和分離膠的分子篩效應(yīng)。在濃縮膠中，緩沖液pH為6.8,HCI幾乎全部解離；甘氨酸的等電點(diǎn)為Ph6,解離度?。坏鞍踪|(zhì)的等電點(diǎn)多為pH5左右，其解離度在HCI和甘氨酸之間，在電場(chǎng)中，遷移率大小次序?yàn)镃I＞Pro＞Gly，電泳開始后，CI超過了蛋白質(zhì)，將蛋白質(zhì)離子推倒它的后面，Gly則將蛋白質(zhì)離子推到它的前面，由于濃縮膠和分離膠的不連續(xù)pH梯度作用，可在二者之間形成三種離子的界面，蛋白質(zhì)離子就聚集在Cl和Gly之間，原來lcm厚的樣品層可以被壓縮至0.25μm，樣品被壓縮成一條狹窄區(qū)帶，從而提高了分離效果。在分離膠中，緩沖液的pH為8.8,甘氨酸進(jìn)入分離膠后解離度大為增加，其遷移率與Cl相仿，泳至蛋白質(zhì)離子前面，因此濃縮效應(yīng)消失。蛋白質(zhì)具有不同的電荷和分子量，在經(jīng)過陰離子去污劑SDS處理后，蛋白質(zhì)分子上的電荷被中和，蛋白質(zhì)分子帶上均一負(fù)電荷，在聚丙烯酰胺凝膠電泳時(shí)，不同的蛋白質(zhì)按照其分子量大小進(jìn)行分布，電泳遷移率僅取決于蛋白質(zhì)的分子量，此時(shí)，由于凝膠濃度增加，孔徑變小，分子篩效應(yīng)起主要作用，使得電泳遷移率僅取決于蛋白質(zhì)的分子量大小。采用考馬斯亮藍(lán)快速染色，可及時(shí)觀察電泳分離效果。二、試劑與材料1、30%（W/V）凝膠貯存液丙烯酰胺30克；甲又雙丙烯酰胺0.8克加蒸餾水溶到100ml，用新華3號(hào)濾紙過濾，棕色瓶中4℃保存2、4×分離膠緩沖液（HCI調(diào)pH至8.8）Tris18.2g;SDS0.4g,加蒸餾水深至100ml3、4×濃縮膠緩沖液（HCI調(diào)pH至6.8）Tris6.06g;SDS0.4g,加蒸餾水溶至100ml4、10×PAGE電泳緩沖液Tris30.3g;Glycine144.2g;SDS10g,加蒸餾水溶至1000ml5、2×蛋白上樣緩沖液（HCI調(diào)pH至6.8）Tris1.21g;SDS4g;2-Mercaptoethanol10ml;Glycerol20ml;BromophenolBlue0.2g,加蒸餾水溶至100ml6、染色液：95%乙醇500ml冰醋酸100ml考馬斯亮藍(lán)2.5g,加蒸餾水溶至1000ml7、脫色液：95%乙醇55ml冰醋酸75ml，加蒸餾水至1000ml8、10%過硫酸銨（AP）、TEMED9、SDS低分子量蛋白Maker97.4、66.2、43、31、20.1、14.4KD10、SDS電泳裝置11、脫色搖床三、操作1、將玻璃板洗滌干凈，固定于電泳憎上，用0.8%瓊脂糖凝膠封底（約高5mm）。2、灌分離膠：7.5%10%12%15%6ml6ml6ml6mlH2O3ml2.5ml2.1ml1.5ml30%凝膠貯存液1.5ml2ml2.4ml3ml4×分離膠緩沖液（pH8.8）1.5ml1.5ml1.5ml1.5ml10%過硫酸銨60μl60μl60μl60μlTEMED3μl2.5μl2μl1.5μl加入TEMED后立即混勻，小心灌入玻璃板夾層中，（膠頂距離Teflon梳子5mm左右），然后用100μl正于醇封頂，保持膠面平整。3、灌濃縮膠：待分離膠凝固后，倒出正丁醇和析出的水相，灌入濃縮膠，插好Teflon梳子。4.5%4.5%4ml2mlH2O2.4ml1.2ml30%凝膠貯存液0.6ml0.3ml4×分離膠緩沖液（pH8.8）1ml0.5ml10%過硫酸銨40μl20μlTEMED4μl2μl4、樣品處理：蛋白樣品加入等體積的2×蛋白上樣緩沖液，沸水浴5-10分鐘（冷卻后上樣）5、上樣：在電泳槽中加入1×PAGE電泳緩沖液，小心拔出梳子，上樣10-20μl.6、電泳：起始用低電壓8V/cm（約60V），當(dāng)溴酚蘭前沿進(jìn)入分離膠后，電壓提高位15V/cm（約120V），直到溴酚蘭泳到膠底為止。關(guān)閉電泳儀。7、剝膠：取出玻璃板，小心撬開，切除封底膠和濃縮膠，切去左右上角作記號(hào)。8、染色和脫色：將凝膠浸泡在染色液中，振蕩染色1-2小時(shí)，有時(shí)可根據(jù)染色液質(zhì)量，染色過夜。然后換脫色液，洗至背景干凈、條帶清晰為止。9、染色和脫色：拍照或用干膠機(jī)干膠保存。注意：1、SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳的有效分離范圍丙烯酰胺濃度（%）線性分離范圍（KD）1512-431016-687.536-945.057-2122、宿主菌都有其自身的蛋白質(zhì)，表達(dá)的產(chǎn)物在SDS電泳時(shí)，其分子量可能會(huì)與宿主菌的蛋白質(zhì)條帶重疊，給分析結(jié)果帶來麻煩，遇到這種情況。一般采用以下幾種辦法來處理：①比較表達(dá)結(jié)果與對(duì)照結(jié)果中各條蛋白帶的濃度，并選擇幾條肉眼看到濃度無差別的蛋白帶為比較對(duì)照，尋找表達(dá)結(jié)果中是否有濃度增加的蛋白條帶。如果有，則可進(jìn)一步分析；②改變電泳膠的濃度（調(diào)整電泳膠的有效分辨范圍），使蛋白重疊條帶分開；③SDS轉(zhuǎn)膜后用抗血清或抗體做免疫westernBlot（免疫印跡實(shí)驗(yàn)），觀察表達(dá)結(jié)果中是否有特異性條帶出現(xiàn)。3、影響蛋白電泳的因素有：①樣品的鹽濃度；②SDS的質(zhì)量；③緩沖液的pH值不準(zhǔn)；④上樣孔的不平整。必要是，可在拔出Teflon梳子后沖洗上樣孔，以防止殘留的丙烯酰胺再凝聚，造成上樣孔的不平齊。實(shí)驗(yàn)四重組蛋白純化：可溶性HisTag-蛋白的抽提一、實(shí)驗(yàn)原理一般在大腸桿菌高效表達(dá)真核基因時(shí)，所產(chǎn)生的產(chǎn)物常以包涵體的形式存在，用超聲儀破裂細(xì)菌后進(jìn)行離心，表達(dá)產(chǎn)物存在于離心管底，而不在上清液內(nèi)，因此當(dāng)上清液內(nèi)分析不到樣品時(shí)，應(yīng)考慮分析離心沉淀物，最好是第一次分析所表達(dá)的產(chǎn)物時(shí)，將兩者同時(shí)進(jìn)行電泳分析，以確定表達(dá)產(chǎn)物在宿主菌內(nèi)的存在形式。包涵體產(chǎn)物一般不能直接用于常規(guī)層析方法進(jìn)行純化，必須用鹽酸服等非離子型強(qiáng)變性劑溶解，并用不同的方法待產(chǎn)物復(fù)性后才能進(jìn)行常規(guī)分離純化，否則會(huì)給后期實(shí)驗(yàn)帶來不便。原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)基因，其產(chǎn)物在宿主中的存在形式并不是固定不變的，隨培養(yǎng)基的營養(yǎng)狀況、誘導(dǎo)培養(yǎng)的時(shí)間和表達(dá)效果的高低而不同。如果能將表達(dá)產(chǎn)物變成可溶性形式，將有昨于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的快速開展，表達(dá)菌培養(yǎng)時(shí)，營養(yǎng)狀況好、誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間短、表達(dá)效率降低都有利于可溶性表達(dá)產(chǎn)物的形成。pET28原核表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)產(chǎn)物C末端均融合帶有HisTag序列蛋白，據(jù)此可用Novagen的His.Binda系列樹脂和劑盒來純化，其原理是通過固定化金屬親和層析（IMAC）來快速一步純化His-Tag序列蛋白。His.Tag序列（6、8或10個(gè)連續(xù)的組氨酸殘基）與固定在NTA-或IDA-的His.Bind樹脂上的二階陽離子Ni2+結(jié)合，洗去未結(jié)合蛋白后，用咪唑或稍低pH的洗脫液進(jìn)行洗脫，從而回收目標(biāo)蛋白。也可用于6M胍或尿素變性法溶解的包涵體蛋白。二、試劑與材料1、細(xì)菌誘導(dǎo)表達(dá)實(shí)驗(yàn)的所有器材2、10mg/ml溶菌酶3、10%TritonX-1004、制冰機(jī)、高速離心機(jī)、超聲波儀5、Novagen公司的NTA-His.Binda樹脂和試劑盒6、SDS實(shí)驗(yàn)的所有器材三、操作：1、樣品準(zhǔn)備（1）準(zhǔn)備細(xì)菌，接種，誘導(dǎo)表達(dá)。[IPTG]：lmM；37℃（或低溫：30℃、24℃等）；3小時(shí)或更長時(shí)間（如過夜）。（2）冰上冷卻后離心，收集細(xì)菌，加入1/20細(xì)菌生長體積的NTA-0Buffer，重懸；加10mg/ml溶菌酶（終濃度0.3mg/ml），冰上放置30分鐘，超聲破碎細(xì)菌。（3）加入10%TritonX-100(終濃度0.1%)，混勻，冰上放置15分鐘，視具體情況可再次超破碎。（4）13000rpm，離心10分鐘，取上清置于冰上，準(zhǔn)備純化。2、純化（1）將NTA樹脂（一般為1ml）裝入層析柱，用NTA-0Buffer洗去乙醇。（2）將上述的上清加到NTA層析柱中，可收集流出成分，用于SDS分析蛋白的結(jié)合情況。（3）用NTA-0Buffer洗4-5次（視具體情況而定），每次1ml，洗去雜蛋白。（4）用NTA-40Buffer洗2次，每次1ml，其中會(huì)含有目的蛋白和雜蛋白。（5）用NTA-100Buffer洗4次，每次500ul，主要含有目的蛋白。（6）用NTA-200Buffer洗4次，每次500ul，主要含有目的蛋白。（7）用NTA-1000Buffer洗2次，每次500ul，主要含有目的蛋白。3、分析每次都要收集流出成分，取100ul樣品進(jìn)行SDS分析，選取雜蛋白最少，目的蛋白最多的樣品進(jìn)行以后的實(shí)驗(yàn)。注意：對(duì)于不同的可溶性蛋白，進(jìn)行純化的洗滌Buffer和洗脫Buffer均不同，所以在條件允許時(shí)可以用含有不同咪唑濃度的Buffer進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，選擇最佳洗滌和洗脫條件進(jìn)行純化蛋白。附：NTABuffer溶液配方NTA-0Buffer：20mMTris-HCIpH7.9,1MNaCl,10%Glycerol.NTA-40Buffer:20mMTris-HCIpH7.9,1MNaCl,10%Glycerol,40mMImidazole.NTA-100Buffer:20mMTris-HCIpH7.9,1mNaCl,10%Glycerol.100mMlmidazole.NTA-200Buffer:20mMTris-HCIpH7.9,1MNaCl,10%Glycerol,200mMImidazole.NTA-1000Buffer：20mMTris-HCIpH7.9,1MNaCl,10%Glycerol,1000mMImidazole.NTA-樹脂上海博彩公司有售實(shí)驗(yàn)五蛋白質(zhì)免疫印跡分析（WesternBlot）一、實(shí)驗(yàn)原理經(jīng)過SDS分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變，以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肋作為杭原與對(duì)應(yīng)的抗體超免疫反應(yīng)，再與酶或同位家標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢查電泳分離的待異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。二、試劑與材料1、SDS實(shí)驗(yàn)的全部材料2、電轉(zhuǎn)移裝置3、硝酸纖維察薄膜（0.45μm），濾紙4、轉(zhuǎn)移電泳緩沖液（pH8.3）Tris3.03gGlycine14.4gMethanol200ml加蒸餾水溶至1000ml5、PBS（pH7.4）Na2HPO412H2O3.63gKH2PO40.24gNaCl8gKCl0.2g加蒸餾水溶至1000ml，15磅（1.034×10Pa）高壓滅菌20分鐘。6、洗滌液（PBST）PBS（pH7.4）1000mlTween200.5ml7、封閉液：含5-6%脫脂奶粉之PBS8、一抗：9、酶標(biāo)二抗：（如辣根過氧化物酶標(biāo)記的SPA）10、底物液（臨用前配）：4一氨一1一蔡酚3mgMcthanol1mlPBS（pH7.4）5ml30%H2O25μl11、玻璃大平皿三、操作：1、對(duì)基因工程產(chǎn)物的蛋白樣品進(jìn)行SDS電泳分離。2、轉(zhuǎn)膜：（1）切除凝膠多余的邊緣部分，用直尺量的膠的長和寬，計(jì)算出面積。然后將膠浸入轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡10min（搖床上進(jìn)行）。（2）載8張同膠大小的濾紙和一張硝酸纖維素膜，均用轉(zhuǎn)移緩沖液平衡10min（搖床上進(jìn)行）。將兩張濾紙疊為一層。（3）從電極負(fù)極到正極依次按下圖順序疊放如下：海綿、濾紙一層、電泳凝膠，硝酸纖維素膜、三層濾紙、海綿，操作時(shí)注意不要有氣泡出現(xiàn)在里面。固定好后放入電泳槽中，接通電源，以每平方厘米4毫安的恒安電流轉(zhuǎn)移30分鐘-45分鐘。3、封閉：轉(zhuǎn)膜結(jié)束，關(guān)閉電源，取出硝酸纖維素膜。將膜浸入封閉液中，脫色搖床上緩慢振蕩30分鐘。4、加一抗：將膜用PBST洗三次，每次五分鐘，然后加入已作適當(dāng)稀釋的一抗中，37℃振蕩1小時(shí)，或室溫緩慢振蕩2小時(shí)，或4℃振蕩過夜。5、加酶標(biāo)二抗：用PBST洗膜三次，每次五分鐘，然后加入酶標(biāo)二抗，37℃振蕩1小時(shí)，室溫振蕩緩慢振蕩2小時(shí)。6、顯色：用PBST洗膜三次，每次五分鐘，然后將膜進(jìn)入到底物液中，輕輕晃動(dòng)數(shù)秒后避光靜置，待特異性條帶清晰顯現(xiàn)即換ddH2O以終止反應(yīng)。注意：1、接觸硝酸纖維素膜需帶手套。2、轉(zhuǎn)移電流不能太大以免產(chǎn)熱過多，影響條帶清晰度。3、封閉液有小牛血清，脫脂奶粉等。但如果封閉液中含有能和一抗結(jié)合的蛋白質(zhì)、就要避免使用這種封閉液。4、PVDF（聚偏二氟乙烯）膜是一種新的固相膜載體，有很好的化學(xué)穩(wěn)定性和機(jī)械強(qiáng)度，固定效果好，敏感度提高，轉(zhuǎn)移后的標(biāo)本不僅可做免疫學(xué)檢測(cè)，而且可直接進(jìn)行蛋白質(zhì)或多膚的氨基酸序列分析。微生物工程學(xué)實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)一種子、發(fā)酵培養(yǎng)基制備及培養(yǎng)基實(shí)消一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模毫私夥N子培養(yǎng)基的配置了解發(fā)酵培養(yǎng)基的配制掌握培養(yǎng)基滅菌的方法二、實(shí)驗(yàn)器材：菌種：重組大腸桿菌種子培養(yǎng)基：牛肉膏、蛋白陳、NaCl、瓊脂糖發(fā)酵培養(yǎng)基：牛肉膏、蛋白陳、NaCl器材：無菌吸管，無菌空平皿，吸球，天平，試管，量筒，小燒杯，大燒杯，玻璃棒，骨匙，pH試紙，分裝漏斗，牛皮紙，麻繩，標(biāo)簽三、操作步驟配：種子斜面、種子平板、種子培養(yǎng)基20ml(50ml三角瓶)一批、發(fā)酵培養(yǎng)基200ml（1000ml三角瓶）一批1、種子培養(yǎng)基配方：牛肉膏-3.0克、蛋白陳-lO.0克、NaCl-5.0克、蒸溜水-1000毫升、調(diào)整pH至7.42、發(fā)酵培養(yǎng)基配方：可溶性淀粉-10g、(NH4)SO4-2.6g、KH2PO4-5.7g、K2HPO4-1.7g、蒸溜水-1000毫升、調(diào)整pH至7.2—7.43、計(jì)算稱量：根據(jù)配方，計(jì)算出實(shí)驗(yàn)中各種藥品所需要的量，然后分別稱(量)取。4、溶解：一船情況下，幾種藥品可一起倒入燒杯內(nèi)、先加入少于所需要的總體積水進(jìn)行加熱溶解(但在配制化學(xué)成分較多的培養(yǎng)基時(shí)，有些藥品，如磷酸鹽和鈣鹽、鎂鹽等混在一起容易產(chǎn)生結(jié)塊、沉淀，故宜按配方依次溶解。個(gè)別成分如能分別溶解，經(jīng)分開滅菌后混合，則效果更為理想)。加熱溶解時(shí)，要不斷攪拌。如有瓊脂在內(nèi)，更應(yīng)注意。待完全溶解后，補(bǔ)足水分到需要的總體積。5、調(diào)節(jié)pH：用滴管逐滴加入1NNaOH或lNHCl邊攪動(dòng)；邊用精密的pH試紙測(cè)其pH值，直到符合要求時(shí)為止。pH值也可用pH計(jì)來測(cè)定。pH值可略高，高壓滅菌后pH值會(huì)下降。6、分裝：按照實(shí)驗(yàn)要求進(jìn)行分裝。裝入試管中的量不宜超過試管高度的1/5，裝入三角燒瓶中的量以燒瓶總體積的一半為限。在分裝過程中，應(yīng)注意勿使培養(yǎng)基沾污管口或瓶口、以免弄濕棉塞，造成污染。7、加塞：培養(yǎng)基分裝好以后，在試管口或燒瓶口上應(yīng)加上一只棉塞。棉塞的作用有二：一方面阻止外界微生物進(jìn)入培養(yǎng)基內(nèi)，防止由此而引起的污染；另一方面保證有良好的通氣性能，使微生物能不斷地獲得無菌空氣。因此棉塞質(zhì)量的好壞對(duì)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果有很大影響。8、滅菌：在塞上棉塞的容器外面再包一層牛皮紙，以防冷凝水沾濕，便可進(jìn)行滅菌。培養(yǎng)基的滅菌時(shí)間和溫度，需按照各種培養(yǎng)基的規(guī)定進(jìn)行，以保證滅菌效果和不損壞培養(yǎng)基的必要成分。常用：121℃如果分裝的斜面，要趁熱擺放并使斜面長度適當(dāng)(為試管長度1/3-l/2，不能超過1/2)。培養(yǎng)基經(jīng)滅菌后，應(yīng)保溫培養(yǎng)2-3天，檢查滅菌效果，無菌生長者方可使用。四、注意事項(xiàng)1、配制固體培養(yǎng)基用的瓊脂應(yīng)先行用冷水浸泡，紗布過濾，在調(diào)好pH值后加入。2、配制發(fā)酵培養(yǎng)基時(shí)應(yīng)小心溶解淀粉，不要成團(tuán)。五、思考題種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基的應(yīng)用原理？實(shí)驗(yàn)二發(fā)酵種子擴(kuò)大培養(yǎng)、一級(jí)種子制備一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?、了解種子擴(kuò)大培養(yǎng)的程序2、學(xué)習(xí)一級(jí)種子制備的方法二、實(shí)驗(yàn)器材：重組大腸桿菌、種子斜面、種子平板、種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基、超凈工作臺(tái)、搖床、移液管等三、操作步驟種子制備1.1將冰箱中保存的重組大腸桿菌菌種，無菌操作下接種于種子斜面，37℃中恒溫培養(yǎng)16-18h.1.2從種子斜面接種種子平板四區(qū)劃線分離，37℃中恒溫培養(yǎng)種子擴(kuò)大培養(yǎng)挑取種子平板上單克隆菌落，接種于20ml種子培養(yǎng)基(50ml三角瓶)，30℃中恒溫?fù)u床培養(yǎng)16-18h，即得新鮮一級(jí)種子制備1000ml三角瓶中裝發(fā)酵培養(yǎng)基200ml，用滅菌移液管吸取20ml新鮮種子液接種于三角瓶中，在搖床中30℃、200rpm條件下恒溫培養(yǎng)四、注意事項(xiàng)將冰箱中保存的菌種取出，應(yīng)在37℃恒溫培養(yǎng)箱中種子培養(yǎng)與一級(jí)種子制備的培養(yǎng)基、時(shí)間均不同。搖床的使用應(yīng)注意轉(zhuǎn)速。五、思考題種子擴(kuò)大培養(yǎng)、一級(jí)種子制備的特點(diǎn)與原理？實(shí)驗(yàn)三接種與發(fā)酵過程控制管理一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模毫私獯竽c桿菌菌發(fā)酵的基本過程。學(xué)習(xí)發(fā)酵過程中的一些重要參數(shù)的調(diào)控。二、實(shí)驗(yàn)器材：5L小型發(fā)酵罐、空氣壓縮機(jī)、蒸汽發(fā)生器、紫外分光光度計(jì)等三、操作步驟1．上罐前的準(zhǔn)備1.1洗凈發(fā)酵罐及各連接管路1.2取配制、滅菌好的發(fā)酵培養(yǎng)基3L，置于罐內(nèi)，并加入適量消泡劑1.3校正pH電極（pH8.0)和溶氧電極1.4按發(fā)酵罐的使用方法滅菌（見附錄）2．上罐時(shí)的操作步驟按工藝要求設(shè)置培養(yǎng)溫度（37℃3．發(fā)酵過程中各指標(biāo)的測(cè)定發(fā)酵過程中，雖然能自動(dòng)監(jiān)控溫度、pH值等重要參數(shù)，但是仍然需要專人負(fù)責(zé)照看，完成下列工作：經(jīng)常注意發(fā)酵罐的運(yùn)轉(zhuǎn)是否正常，檢查各控制參數(shù)是否在合適的范圍內(nèi)，遇到故障及時(shí)排除。每3h取樣測(cè)定：發(fā)酵液的光密度值、鏡檢觀察細(xì)胞形態(tài)，以了解細(xì)胞的生長情況及檢查是否有雜菌污染。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，適當(dāng)調(diào)節(jié)進(jìn)氣量和攪拌轉(zhuǎn)速，以維持一定的DO值（溶氧濃度）。定時(shí)取樣，放入冰箱冷藏保存，至發(fā)酵結(jié)束后集中測(cè)定SOD酶活大小。每小時(shí)記錄發(fā)酵過程的培養(yǎng)溫度、攪拌轉(zhuǎn)速、pH、溶氧濃度、空氣流量等參數(shù)，并記錄操作情況。4．放罐經(jīng)過大約48h發(fā)酵，菌體生長進(jìn)入穩(wěn)定期，便可放罐。發(fā)酵液離心后得到的上清液進(jìn)入下一步的分離提純操作。5．清洗放罐后，向發(fā)酵罐內(nèi)加入2.5L水，攪拌片刻，取出pH、DO電極，清洗干凈并要求進(jìn)行保養(yǎng)放置。四、注意事項(xiàng)應(yīng)嚴(yán)格按照工藝要求規(guī)范操作，合理安排輪流值班。五、思考題整理發(fā)酵過程中所測(cè)定的各種數(shù)據(jù)資料。寫出發(fā)酵過程各操作步驟。實(shí)驗(yàn)四發(fā)酵液SOD活性檢測(cè)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆彰富顪y(cè)定方法學(xué)習(xí)發(fā)酵過程中的一些重要參數(shù)的調(diào)控二、基本原理見生化工程SOD粗酶液提取部分。三、操作1.將發(fā)酵液進(jìn)行離心，6000rpm，10min，收集沉淀用2.5mM磷酸鉀緩沖液洗滌2次，離心收集菌體。2.用2.5mM磷酸鉀緩沖液15mL將菌體重懸，超聲破碎細(xì)菌至細(xì)菌懸液變的清亮透明。8000rpm，10min，上清即為SOD粗酶液。3.測(cè)定SOD酶活性，具體見生化工程酶活性測(cè)定一章。

生化工程學(xué)實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)一超氧化物歧化酶粗酶液的分離純化一目的與要求(1)通過超氧化物歧化酶的分離純化,了解有機(jī)溶劑沉淀蛋白質(zhì)以及纖維素離子交換層析方法的原理。(2)掌握測(cè)定超氧化物歧化酶活性和比活力的方法。二原理超氧化物歧化酶(Superoxidedismutase)簡稱SOD,它廣泛存在于各類生物體內(nèi),按其所含金屬離子的不同,可分為3種:銅鋅超氧化物歧化酶(Cu·Zn-SOD)、錳超氧化物歧化酶(Mn-SOD)和鐵超氧化物歧化酶(Fe-SOD)。SOD催化如下反應(yīng):O2.-+O2-+2H+→H202+02在生物體內(nèi),它是一種重要的自由基清除劑,能治療人類多種炎癥、放射病、自身免疫性疾病和抗衰老,對(duì)生物體有保護(hù)作用。在重組大腸桿菌里Mn-SOD與菌體蛋白等共存于細(xì)菌內(nèi),當(dāng)細(xì)菌破裂后,用氯仿–乙醇處理溶血液,使菌體蛋白沉淀,而Mn-SOD-SOD則留在水-乙醇均相溶液中。磷酸氫二鉀極易溶于水,在乙醇中的溶解度甚低,將磷酸氫二鉀加入水-乙醇均相溶液中時(shí),溶液明顯分層,上層是具有Cu·Zn-SOD活性的含水-乙醇相,下層是溶解大部分磷酸氫二鉀的水相(比重大)。用分液漏斗處理,收集上層具有SOD活性的含水-乙醇相,再加入有機(jī)溶劑丙酮，使SOD沉淀。極性有機(jī)溶劑能引起蛋白質(zhì)脫去水化層,并降低介電常數(shù)而增加帶電質(zhì)點(diǎn)間的相互作用,致使蛋白質(zhì)顆粒凝集而沉淀。采用這種方法沉淀蛋白質(zhì)時(shí),要求在低溫下操作,并且需要盡量縮短處理時(shí)間,避免蛋白質(zhì)變性。將上一步收集的SOD丙酮沉淀物溶于蒸餾水中,在pH7.6的條下,Cu·Zn-SOD帶負(fù)電,過DE-52纖維素陰離子交換柱可得到進(jìn)一步純化。三試劑和器材1、材料重組大腸桿菌發(fā)酵液。2、試劑95%乙醇,氯仿,k2HP04·3H20,丙酮,pH7.6,2.5mmol/L磷酸鉀緩沖液,2OOmmol/L磷酸鉀緩沖液,DE-52纖維素等。3、器材離心機(jī),751-GW型分光光度計(jì),梯度混合器,玻璃柱(1.0×10cm),試管,自動(dòng)收集器,紫外檢測(cè)儀,移液管,量筒,燒杯,四、操作1.將50mL發(fā)酵液進(jìn)行離心，6000rpm，10min，收集沉淀用2.5mM磷酸鉀緩沖液洗滌2次，離心收集菌體。2.用2.5mM磷酸鉀緩沖液15mL將菌體重懸，超聲破碎細(xì)菌至細(xì)菌懸液變的清亮透明。8000rpm，10min，上清即為SOD粗酶液（留樣1mL測(cè)酶活和蛋白含量）。3.向上清中緩慢加入在4℃下預(yù)冷過的95%乙醇125mL(0.25倍體積),然后再緩慢加入在4℃下預(yù)冷過的氯仿75mL(0.15倍體積),充分?jǐn)嚢?室溫下600Orpm，10min,棄去沉淀,收集上清液約12mL(留樣0.5mL測(cè)酶活和蛋白含量4.加入K2HP04·3H20(按43gk2HP04·3H20/100mL粗提液的比例),轉(zhuǎn)移到分液漏斗,振搖后靜置5min,見分層明顯。收集上層乙醇-氯仿相(微混濁),室溫下離心6000rpm，10min,棄去沉淀,得上清液約8mL(留樣0.5mL測(cè)酶活和蛋白含量)。5.向上一步得到的上清液加入0.75倍體積在4℃下預(yù)冷過的丙酮,Mn-SOD便沉淀下來。室溫下離心6000rpm，10min,收集灰白色沉淀物。將此灰白色沉淀物溶于約3mL重蒸水中(呈懸浮狀),在4℃下,對(duì)250mLpH7.6,2.5mmol/L的磷酸鉀緩沖液透析,每隔0.5h以上,換透析外液1次,共換2-3次。透析內(nèi)液如出現(xiàn)沉淀,需在室溫下6000rpm，10min,棄去沉淀,收集上清液約5ml(留樣6.DE-52纖維素柱層析DE-52纖維素的處理:稱量DE-32纖維素干品5-6g用自來水浮選除去1-2min不下沉的細(xì)小顆粒,用G3燒結(jié)漏斗抽干,濾餅放人燒杯中,加適量lmol/LNaOH溶液,攪勻后放置15min,用G3燒結(jié)漏斗抽濾,水洗至中性,濾餅懸浮于lmol/LHCl溶液中,攪勻后放置lOmin后用G3燒結(jié)漏斗抽濾,水洗至中性,濾餅再懸浮于1mol/LNaOH溶液中,抽濾,水洗至中性,最后將濾餅懸浮于層析柱平衡緩沖液中待用。DE-32纖維素使用后的回收處理與上述步驟相同,只是不用HCl所用NaOH，濃度改為0.5mol/L。 將上一步所得離心上清液過DE-32纖維素柱。柱體1.O×10cm,用pH7.6,2.5mmol/L磷酸鉀緩沖液作層析柱平衡液,用pH7.6,25mmol/L(100mL)-200mmol/L(l00mL)的磷酸鉀緩沖液進(jìn)行梯度洗脫。流速30mL/h,每管收集3mL,記錄總體積。.實(shí)驗(yàn)二超氧化物歧化酶蛋白濃度和酶活性的測(cè)定一目的要求掌握蛋白含量和SOD酶活性的測(cè)定方法。二、原理根據(jù)國際酶學(xué)委員會(huì)規(guī)定，酶的比活性用每毫克蛋白質(zhì)具有的活性單位來表示，因此，測(cè)定樣品的比活性必須測(cè)定：（1）每毫升樣品中的蛋白質(zhì)毫克數(shù)。（2）每毫升樣品中的酶活性單位數(shù)。超氧化物歧化酶活性的測(cè)定方法較多,常采用鄰苯三酚((HO)3C6H81,2,3-benzenetriol)自氧化法。鄰苯三酚自氧化的機(jī)理極為復(fù)雜,它在堿性條件下,能迅速自氧化,釋放出O2-,生成帶色的中間產(chǎn)物。反應(yīng)開始后,反應(yīng)液先變成黃棕色,幾分鐘后轉(zhuǎn)綠,幾小時(shí)后又轉(zhuǎn)變成黃色,這是因?yàn)樯傻闹虚g物不斷氧化的結(jié)果。這里測(cè)定的是鄰苯三酚自氧化過程中的初始階段,中間物的積累在滯留30-45s后,與時(shí)間成線性關(guān)系,一般線性時(shí)間維持在4min的范圍內(nèi)。中間物在420nm波長處有強(qiáng)烈光吸收,當(dāng)有SOD存在時(shí),由于它能催化O2-與H+結(jié)合生成02和H202,從而阻止了中間物的積累,因此,通過計(jì)算就可求出SOD 鄰苯三酚自氧化速率受pH,濃度和溫度的影響,其中pH影響尤甚,因此,測(cè)定時(shí)要求對(duì)pH嚴(yán)格掌握?，F(xiàn)試劑公司開發(fā)的SOD試劑盒使用較方便，靈敏度高。測(cè)定蛋白質(zhì)含量可用卡馬斯亮藍(lán)法，該方法靈敏度高，操作簡便。三、試劑pH8.的100mmol/LTris-二甲胂酸鈉緩沖液(內(nèi)含2mmol/L)二乙基三氨五乙酸)，10mmol/LHCL，6mmol/L連苯三酚，卡馬斯亮藍(lán)G250，標(biāo)準(zhǔn)蛋白等等。四、操作1.卡馬斯亮藍(lán)法測(cè)蛋白（1）取7只試管，編號(hào)，按下表操作：12345標(biāo)準(zhǔn)空白各階段樣品（毫升）0.10.20.20.30.5蒸餾水0.40.30.30.20.40.5標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液1g/L（毫升）0.1G250（毫升）5.05.05.05.05.05.05.0立即混勻，室溫放置2-3分鐘，595nm比色，空白管調(diào)零。（2）計(jì)算出各階段樣品的蛋白濃度。2.酶活性的測(cè)定 （1）鄰苯三酚自氧化速率的測(cè)定 在試管中按表441加入緩沖液和重蒸水,25℃下保溫20min,然后加入25℃預(yù)熱過的鄰苯三酚(對(duì)照管用10mmol/LHC1代替鄰苯三酚),迅速搖勻,立即傾人比色杯中,在420nm波長處測(cè)定A值,每隔30s讀數(shù)一次,要求自氧化速率控制在0.06OA/mn(可增減鄰苯三酚的加人量,使速率正好是（2）酶活性的測(cè)定酶活性的測(cè)定按表2加樣,操作與測(cè)定鄰苯三酚自氧化速率相同。根據(jù)酶活性情況可適當(dāng)增減酶樣品的加入量。 酶活性單位的定義:在lmL反應(yīng)液中,每分鐘抑制鄰苯三酚自氧化速率達(dá)50%時(shí)的酶量定義為一個(gè)活性單位,即在420nm波長處測(cè)定時(shí),0.03OA/min為一個(gè)活性單位。若每分鐘抑制鄰苯三酚自氧化速率在35-65%范圍,通常可按比例計(jì)算,若數(shù)值不在此范圍時(shí),應(yīng)增減樣品加入量。表1領(lǐng)苯三酚自氧化速度測(cè)定加樣表試劑對(duì)照管/mL樣品管/mL最終濃度/(mmol/L)pH8.的100mmol/LTris-二甲胂酸鈉緩沖液(內(nèi)含2mmol/L)二乙基三氨五乙酸)4.54.550,Ph8.2Tris-二甲胂酸鈉緩沖液(內(nèi)含1mmol/L)二乙基三氨五乙酸)重蒸水4.24.2-10mmol/LHCL0.3--6mmol/L連苯三酚-0.30.2總體積99-0.060―酶樣品管自氧化速率0.060（0.060―酶樣品管自氧化速率0.060XX100%50%每毫升酶液活性單位（U/mL）=50%酶樣品液稀釋倍數(shù)酶樣品液稀釋倍數(shù)酶樣品液體積X反應(yīng)液總體積X酶樣品液體積總活性（U）=每毫升酶液活性單位(U/mL)X酶原液總體積每毫升酶液活性單位每毫升酶液活性單位(U/mL)比活==總活性單位數(shù)(U)每毫升蛋白濃度每毫升蛋白濃度(mg/mL)總蛋白(mg)表2酶活性測(cè)定加樣表試劑對(duì)照管/mL樣品管/mL最終濃度/(mmo