引物設(shè)計冷麗2011-04-02引物設(shè)計需要考慮的問題引物長度（primerlength）產(chǎn)物長度（productlength）序列Tm值(meltingtemperature)ΔG值(internalstability)引物本身和引物之間二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)錯誤引發(fā)位點（falseprimingsite）引物及產(chǎn)物GC含量（composition）PCR引物設(shè)計原則1.引物長度一般在15~30堿基之間。

引物長度常用的是18-27bp，但不應(yīng)大于38bp，因為過長會導(dǎo)致其延伸溫度大于74℃，不適于TaqDNA聚合酶進行反應(yīng)。2.引物GC含量在40~60%之間，Tm值最好接近72℃GC含量過高或過低都不利于引發(fā)反應(yīng)。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值是寡核苷酸的解鏈溫度，即50%寡核苷酸雙鏈解鏈的溫度。一般有效引物的Tm為55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使復(fù)性條件最佳。PCR引物設(shè)計原則3.引物3’端要避開密碼子的第3位。如擴增編碼區(qū)域，引物3′端不要終止于密碼子的第3位，因密碼子的第3位易發(fā)生簡并，會影響擴增的特異性與效率。4.引物3’端不能選擇A。

引物3′端錯配時，不同堿基引發(fā)效率存在著很大的差異，當(dāng)末位的堿基為A時，即使在錯配的情況下，也能有引發(fā)鏈的合成，而當(dāng)末位鏈為T時，錯配的引發(fā)效率大大降低，G、C錯配的引發(fā)效率介于A、T之間，所以3′端最好選擇T。PCR引物設(shè)計原則5.堿基要隨機分布。引物序列在模板內(nèi)應(yīng)當(dāng)沒有相似性較高，尤其是3’端相似性較高的序列，否則容易導(dǎo)致錯誤引發(fā)。降低引物與模板相似性的一種方法是，引物中四種堿基的分布最好是隨機的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不應(yīng)超過3個連續(xù)的G或C，因這樣會使引物在GC富集序列區(qū)錯誤引發(fā)。6.引物自身及引物之間不應(yīng)存在互補序列。引物自身不應(yīng)存在互補序列，否則引物自身會折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu)使引物本身復(fù)性。這種二級結(jié)構(gòu)會因空間位阻而影響引物與模板的復(fù)性結(jié)合。引物自身不能有連續(xù)4個堿基的互補。兩引物之間也不應(yīng)具有互補性，尤其應(yīng)避免3′端的互補重疊以防止引物二聚體的形成。引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)如果不可避免的話，應(yīng)盡量使其△G值不要過高（應(yīng)小于4.5kcal/mol）。否則易導(dǎo)致產(chǎn)生引物二聚體帶，并且降低引物有效濃度而使PCR反應(yīng)不能正常進行。PCR引物設(shè)計原則7.引物5’端和中間△G值應(yīng)該相對較高，而3’端較低。△G值是指DNA雙鏈形成所需的自由能，它反映了雙鏈結(jié)構(gòu)內(nèi)部堿基對的相對穩(wěn)定性，△G值越大，則雙鏈越穩(wěn)定。應(yīng)當(dāng)選用5′端和中間△G值相對較高，而3′端△G值較低（絕對值不超過9）的引物。8.引物的5’端可以修飾，而3′端不可修飾。引物的5′端決定著PCR產(chǎn)物的長度，它對擴增特異性影響不大。因此，可以被修飾而不影響擴增的特異性。引物5′端修飾包括：加酶切位點；標(biāo)記生物素、熒光、地高辛等；引入蛋白質(zhì)結(jié)合DNA序列；引入點突變、插入突變、缺失突變序列。PCR引物設(shè)計原則9.擴增產(chǎn)物的單鏈不能形成二級結(jié)構(gòu)。

某些引物無效的主要原因是擴增產(chǎn)物單鏈二級結(jié)構(gòu)的影響，選擇擴增片段時最好避開二級結(jié)構(gòu)區(qū)域。用有關(guān)軟件可以預(yù)測估計mRNA的穩(wěn)定二級結(jié)構(gòu)，有助于選擇模板。10.引物應(yīng)具有特異性。引物設(shè)計完成以后，應(yīng)對其進行BLAST檢測。最好與其它基因不具有互補性。PCR引物設(shè)計常用軟件Primer5，強大的引物搜索功能，限制性內(nèi)切酶位點分析。Oligo6，引物搜索功能，較強的引物分析評價功能。Primer5的使用方法Primer5的使用方法Primer5的使用方法Primer5的使用方法Primer5的使用方法Primer5的使用方法Primer5的使用方法Oligo6的使用方法Oligo6的使用方法Oligo6的使用方法Oligo6的使用方法Oligo6的使用方法Real-TimePCR引物設(shè)計原則做RealTime時,引物與一般PCR的引物,在引物設(shè)計上所要求的參數(shù)是不同的。引物設(shè)計的要求：

1）避免重復(fù)堿基，尤其是G2)Tm=58-60度。

3）GC=30-80%.

4）3'端最后5個堿基內(nèi)不能有多于2個的G或C.

5)PCR擴增產(chǎn)物長度：引物的產(chǎn)物大小不要太大，一般在80-250bp之間都可；80～150bp最為合適（可以延長至300bp）。

6)引物的退火溫度要高，一般要在60度以上；要特