1、蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)、測(cè)定及分離純化,蛋白質(zhì)的理化性質(zhì),蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)及應(yīng)用,蛋白質(zhì)分子量大，是一種膠體溶液； 具有特定的空間構(gòu)象，分子量一定分子篩層析； 在大部分pH條件下，蛋白質(zhì)分子同時(shí)存在兩種電荷等電點(diǎn)沉淀，鹽溶，鹽析，電泳，離子交換層析等； 一般而言，蛋白質(zhì)分子上同時(shí)存在疏水和親水區(qū)域有機(jī)溶劑沉淀，疏水層析(反相層析)。,蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì),蛋白質(zhì)分子量大，介于一萬(wàn)到百萬(wàn)之間，故其分子的大小已達(dá)到膠粒1-100 nm范圍之內(nèi)。球狀蛋白質(zhì)的表面多親水基團(tuán)，具有強(qiáng)烈吸引水分子的作用，使蛋白質(zhì)分子表面常為多層水分子所包圍-水化膜，從而阻止蛋白質(zhì)顆粒的相互聚集。 與低分子物質(zhì)相比，蛋白質(zhì)分子擴(kuò)散速

2、度慢，不易透過半透膜，粘度大，在分離提純蛋白質(zhì)過程中，可以利用蛋白質(zhì)的這一性質(zhì)，將混有小分子雜質(zhì)的蛋白質(zhì)溶液置于半透膜制成的透析袋或管內(nèi)，浮于流動(dòng)水或適宜的緩沖液中，小分子雜質(zhì)皆易從袋中透出，保留了比較純的蛋白質(zhì)-透析(dialysis)。,顆粒大小：在1-100 nm之間，屬膠體，因此溶于水，成為親水膠體。 穩(wěn)定親水膠體的因素： 水化膜 表面電荷相同 不通透性：半透膜(semipermeable membrane),蛋白質(zhì)溶液是一種分散系統(tǒng)，蛋白質(zhì)分子顆粒是分散相，水是分散介質(zhì)。分散相質(zhì)點(diǎn)小于1 nm為真溶液，大于100 nm為懸濁液，介于1-100 nm為膠體溶液。,透析即用半透膜（透析袋

3、）將大分子蛋白質(zhì)分離出來(lái)。在生物大分子制備過程中除去鹽、少量有機(jī)溶劑、生物小分子雜質(zhì)和濃縮樣品，透析法最簡(jiǎn)便。 透析時(shí)，小于MWCO（截留分子量）的分子在透析膜二邊溶液濃度差產(chǎn)生的擴(kuò)散壓作用下滲過透析膜，其速度與濃度梯度、膜面積及溫度成正比。欲快速透析可采用直徑較小的透析袋以增加膜面積。常用溫度：4，升溫、更換袋外透析液或用磁力攪拌器，均能提高透析速度。,MWCO: molecular weight cut-off,疏水區(qū)域,蛋白質(zhì)分子上的電荷與疏水區(qū),蛋白質(zhì)大分子溶液在一定溶劑中超速離心時(shí)可發(fā)生沉降。沉降速度與向心加速度之比值即為蛋白質(zhì)的沉降系數(shù)S。 s=v/2r s是沉降系數(shù)(sedime

4、ntation coefficient)，是離心轉(zhuǎn)子的角速度（弧度/秒），r是到旋轉(zhuǎn)中心的距離，v是沉降速度。沉降系數(shù)以每單位重力的沉降時(shí)間表示，蛋白質(zhì)、核酸、核糖體、病毒等的沉降系數(shù)通常為1-200 10-13秒范圍，10-13這個(gè)因子叫做沉降單位S（斯維德貝格單位，Svedberg unit），即1S=10-13秒，如血紅蛋白的S約為410-13秒或4S。大多數(shù)蛋白質(zhì)和核酸的沉降系數(shù)在4S和40S之間，核糖體及其亞基在30S和80S之間，多核糖體在100S以上。,1924年Svedberg（離心法創(chuàng)始人-瑞典蛋白質(zhì)化學(xué)家）對(duì)沉降系數(shù)的定義：顆粒在單位離心力場(chǎng)中粒子移動(dòng)的速度。,蛋白質(zhì)的兩性

5、電離和等電點(diǎn),蛋白質(zhì)由氨基酸組成，分子中除兩端的游離氨基和羧基外，側(cè)鏈上還有一些解離基團(tuán)，如Glu、Asp殘基中的和-羧基，Lys殘基中的-氨基，Arg殘基的胍基和His的咪唑基。作為帶電顆粒，可以在電場(chǎng)中移動(dòng)，移動(dòng)方向取決于蛋白質(zhì)分子所帶的電荷性質(zhì)。蛋白質(zhì)顆粒在溶液中所帶的電荷，既取決于其分子組成中堿性和酸性氨基酸的含量，又受所處溶液pH影響。當(dāng)處于某一pH時(shí)，蛋白質(zhì)兼性離子(zwitterion)的凈電荷為0，此時(shí)溶液的pH值為蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)(isoelectric point，pI)。處于等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)顆粒，在電場(chǎng)中并不移動(dòng)。蛋白質(zhì)溶液的pH大于等電點(diǎn)，該蛋白質(zhì)顆粒帶負(fù)電荷，反之則帶正電

6、荷。,溶液中的蛋白質(zhì)顆粒,pH=pI時(shí)，蛋白質(zhì)分子所帶凈電荷為零，蛋白質(zhì)分子在電場(chǎng)中不移動(dòng)。 pHpI時(shí)，蛋白質(zhì)分子所帶凈電荷為負(fù)，蛋白質(zhì)分子在電場(chǎng)中向陽(yáng)極移動(dòng)。 pHpI時(shí)，蛋白質(zhì)分子所帶凈電荷為正，蛋白質(zhì)分子在電場(chǎng)中向陰極移動(dòng)。 在pI時(shí)，蛋白質(zhì)失去了膠體的穩(wěn)定條件，即沒有相同電荷相互排斥的作用，所以不穩(wěn)定，溶解度最小，易沉淀。,蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)的溶解度最小,pH與鹽濃度對(duì)蛋白質(zhì)溶解度的共同作用,蛋白質(zhì)的變性(Denaturation),天然蛋白質(zhì)的嚴(yán)密結(jié)構(gòu)在某些物理或化學(xué)因素作用下，其特定的空間結(jié)構(gòu)被破壞，從而導(dǎo)致理化性質(zhì)改變和生物學(xué)活性的喪失，如酶失去催化活力、激素喪失活性，即蛋白質(zhì)的

7、變性作用(denaturation)。變性只是蛋白質(zhì)空間構(gòu)象的破壞，一般認(rèn)為蛋白質(zhì)變性的本質(zhì)是次級(jí)鍵、二硫鍵的破壞，并不涉及一級(jí)結(jié)構(gòu)的變化。,引起蛋白質(zhì)變性的因素,引起蛋白質(zhì)變性的原因可分為物理和化學(xué)因素兩大類。物理因素可以是加熱、加壓、脫水、攪拌、振蕩、紫外線照射、超聲波的作用等；化學(xué)因素有強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、尿素、重金屬鹽、十二烷基磺酸鈉(SDS)等。在臨床醫(yī)學(xué)上，變性因素常被應(yīng)用于消毒及滅菌。反之，注意防止蛋白質(zhì)變性就能有效地保存蛋白質(zhì)制劑。,在變性因素的作用下，可導(dǎo)致各種變性現(xiàn)象。首先是生理活性喪失，如酶變性后，失去 催化功能；激素變性后，失去生理調(diào)節(jié)功能；微生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)變性后，微生物失去

8、生命 力而死亡。這是變性作用最主要的特征。此外，變性后的蛋白質(zhì)還表現(xiàn)出各種物理和化學(xué)性 質(zhì)的改變。天然蛋白質(zhì)變性后，多肽鏈松弛伸展，導(dǎo)致粘度增大，內(nèi)部的側(cè)鏈?zhǔn)杷鶊F(tuán)暴露 于表面，導(dǎo)致溶解度下降而易沉淀。同時(shí)由于變性后，結(jié)構(gòu)松散，側(cè)鏈基團(tuán)暴露，還使得其 易于發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，例變性蛋白質(zhì)容易被酶水解。由于疏水側(cè)鏈暴露，可能導(dǎo)致紫外吸收增加。,變性與復(fù)性,變性并非完全是不可逆的變化，當(dāng)變性程度較輕時(shí)，去除變性因素，有的蛋白質(zhì)仍能恢復(fù)或部分恢復(fù)其原來(lái)的構(gòu)象及功能，變性的可逆變化稱為復(fù)性(renaturation)。如核糖核酸酶中四對(duì)二硫鍵及其氫鍵，在-巰基乙醇和8 M尿素作用下，發(fā)生變性，失去生物學(xué)活性

9、，變性后如經(jīng)過透析去除尿素，-巰基乙醇，并對(duì)空氣緩慢氧化使疏基氧化成二硫鍵，酶蛋白又可恢復(fù)其原來(lái)的構(gòu)象，酶學(xué)活性也幾乎全部恢復(fù)，稱為變性核糖核酸酶的復(fù)性。 許多蛋白質(zhì)變性時(shí)被破壞嚴(yán)重，即使撤去變性因素也不能恢復(fù)，稱為不可逆性變性。,RNase的變性與復(fù)性,鹽 析 (Salting Out),在蛋白質(zhì)溶液中加入大量的中性鹽以破壞蛋白質(zhì)膠體的穩(wěn)定性而使其析出，這種方法稱為鹽析。常用的中性鹽有硫酸銨、硫酸鈉、氯化鈉等。各種蛋白質(zhì)鹽析時(shí)所需的鹽濃度及pH不同，故可用于對(duì)混和蛋白質(zhì)組分的分離。例如用半飽和的硫酸銨來(lái)沉淀出血清中的球蛋白，飽和硫酸銨可以使血清中的白蛋白、球蛋白都沉淀出來(lái)，鹽析沉淀的蛋白質(zhì)，

10、經(jīng)透析除鹽，仍保證蛋白質(zhì)的活性。調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)溶液的pH至等電點(diǎn)后，再用鹽析法則蛋白質(zhì)沉淀的效果更好。,蛋白質(zhì)的鹽溶和鹽析,硫酸銨對(duì)馬血紅蛋白的溶解度的影響,離子強(qiáng)度（硫酸銨濃度）,鹽 析,鹽溶,蛋白質(zhì)的沉淀 (Precipitation),蛋白質(zhì)分子凝聚從溶液中析出的現(xiàn)象-蛋白質(zhì)沉淀，變性蛋白質(zhì)一般易于沉淀，但也可不變性而使蛋白質(zhì)沉淀，在一定條件下，變性的蛋白質(zhì)也可不發(fā)生沉淀。 蛋白質(zhì)所形成的親水膠體顆粒具有兩種穩(wěn)定因素，即顆粒表面的水化層和電荷。若無(wú)外加條件，不致互相凝集。然而除掉這兩個(gè)穩(wěn)定因素(如調(diào)節(jié)溶液pH至pI和加入脫水劑)，蛋白質(zhì)便容易凝集析出。但如將溶液pH調(diào)節(jié)到蛋白質(zhì)pI，蛋白質(zhì)分

11、子呈等電狀態(tài)，雖然分子間同性電荷相互排斥作用消失了。但是還有水化膜起保護(hù)作用，一般不致于發(fā)生凝聚作用，如果這時(shí)再加入某種脫水劑，除去蛋白質(zhì)分子的水化膜，則蛋白質(zhì)分子就會(huì)互相凝聚而析出沉淀；反之，若先使蛋白質(zhì)脫水，然后再調(diào)節(jié)pH到等電點(diǎn)，也同樣可使蛋白質(zhì)沉淀析出。,蛋白質(zhì)膠體顆粒的沉淀,（沉淀）,（疏水膠體）,（疏水膠體）,重金屬鹽沉淀蛋白質(zhì),蛋白質(zhì)可以與重金屬離子如汞、鉛、銅、銀等結(jié)合成鹽沉淀，沉淀的條件以pH稍大于等電點(diǎn)為宜。因?yàn)榇藭r(shí)蛋白質(zhì)分子有較多的負(fù)離子，易與重金屬離子結(jié)合成鹽。重金屬沉淀的蛋白質(zhì)常是變性的，但若在低溫條件下，并控制重金屬離子濃度，也可用于分離制備不變性的蛋白質(zhì)。 臨床上

12、利用蛋白質(zhì)能與重金屬鹽結(jié)合的這種性質(zhì)，搶救誤服重金屬鹽中毒的病人，給病人口服大量蛋白質(zhì)，然后用催吐劑將結(jié)合的重金屬鹽嘔吐出來(lái)解毒。,生物堿試劑以及某些酸類沉淀蛋白質(zhì),蛋白質(zhì)可與生物堿試劑(如苦味酸、鎢酸、鞣酸)以及某些酸(如三氯醋酸、過氯酸、硝酸)結(jié)合成不溶性的鹽沉淀，沉淀的條件應(yīng)當(dāng)是pH小于等電點(diǎn)，這樣蛋白質(zhì)帶正電荷易于與酸根負(fù)離子結(jié)合成鹽。 臨床血液化學(xué)分析時(shí)常利用此原理除去血液中的蛋白質(zhì)，此類沉淀反應(yīng)也可用于檢驗(yàn)?zāi)蛑械鞍踪|(zhì)。,有機(jī)溶劑沉淀蛋白質(zhì),可與水混合的有機(jī)溶劑，如酒精、甲醇、丙酮等，對(duì)水的親和力很大，能破壞蛋白質(zhì)顆粒的水化膜，在等電點(diǎn)時(shí)使蛋白質(zhì)沉淀。在常溫下，有機(jī)溶劑沉淀蛋白質(zhì)往往

13、引起變性。例如酒精消毒滅菌就是如此，但若在低溫條件下，則變性進(jìn)行較緩慢，可用于分離制備各種血漿蛋白質(zhì)。,不可逆沉淀,指沉淀出來(lái)的蛋白質(zhì)分子，其內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生了較大的改變，蛋白質(zhì)已失去了原來(lái)的生物活性，即使沉淀因素消失，沉淀也不重新溶解。 在蛋白質(zhì)溶液中加入某些水溶性的有機(jī)溶劑，如丙酮、乙醇等，由于這些溶劑與水的親和力大于蛋白質(zhì)，破壞了蛋白質(zhì)膠體外層的水化膜，并可逐步進(jìn)入蛋白質(zhì)的內(nèi)部，有利于蛋白質(zhì)的沉淀，此種作用在短時(shí)間及低溫時(shí)，沉淀是可逆的，但作用時(shí)間長(zhǎng)或溫度較高時(shí)，則是不可逆沉淀。,三氯乙酸、苦味酸、磷鎢酸、鞣酸等生物堿沉淀試劑，能與蛋白質(zhì)陽(yáng)離子結(jié)合生成不溶物, 而使蛋白質(zhì)發(fā)生不可逆沉淀。如：

14、 +H3N-Pr-COO- + Cl3C-COO- H2N-Pr-COO-O-CO-CCl3 Cu2+、Hg2+、Pb2+、Ag+等重金屬陽(yáng)離子，能與蛋白質(zhì)陰離子結(jié)合生成不溶物，使蛋白質(zhì)發(fā)生不可逆沉淀。例如： H2N-Pr-COO- +Ag+ H2N-Pr-COOAg,加熱凝固 (Coagulation),將接近于等電點(diǎn)附近的蛋白質(zhì)溶液加熱，可使蛋白質(zhì)發(fā)生凝固而沉淀。加熱首先使蛋白質(zhì)變性，有規(guī)則的肽鏈結(jié)構(gòu)被打開呈松散狀不規(guī)則的結(jié)構(gòu)，分子的不對(duì)稱性增加，疏水基團(tuán)暴露，進(jìn)而凝聚成凝膠狀的蛋白塊。如煮熟的雞蛋，蛋黃和蛋清都凝固。 蛋白質(zhì)的變性、沉淀、凝固之間有密切的關(guān)系。但蛋白質(zhì)變性后并不一定沉淀，

15、變性蛋白質(zhì)只在等電點(diǎn)附近才沉淀，沉淀的變性蛋白質(zhì)也不一定凝固。如蛋白質(zhì)被強(qiáng)酸、強(qiáng)堿變性后由于蛋白質(zhì)顆粒帶有大量電荷，仍溶于強(qiáng)酸或強(qiáng)減之中。但若將強(qiáng)堿或強(qiáng)酸溶液的pH調(diào)節(jié)到pI，則變性蛋白質(zhì)凝集成絮狀沉淀物，若將此絮狀物加熱，則分子間相互盤纏而變成較為堅(jiān)固的凝塊。,蛋白質(zhì)的紫外吸收,波長(zhǎng)：280 nm 引起紫外吸收的因素：主要是色氨酸( Trp）和酪氨酸（ Tyr)的共軛雙鍵，Phe在紫外光區(qū)也有光吸收。 可用于蛋白質(zhì)的定量測(cè)定。,波長(zhǎng)范圍：200-400 nm,蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng) I,1. 雙縮脲反應(yīng)(biuret reaction)，蛋白質(zhì)在堿性溶液中與硫酸銅作用呈現(xiàn)紫紅色，稱雙縮脲反應(yīng)。凡分

16、子中含有兩個(gè)以上CONH鍵的化合物都呈此反應(yīng)，蛋白質(zhì)分子中氨基酸是以肽鍵相連，因此所有蛋白質(zhì)都能與雙縮脲試劑發(fā)生反應(yīng)。 2. 米倫反應(yīng)(millon reaction)，蛋白質(zhì)溶液中加入米倫試劑(亞硝酸汞、硝酸汞及硝酸的混和液)，蛋白質(zhì)首先沉淀，加熱則變?yōu)榧t色沉淀，此為酪氨酸的酚核所特有的反應(yīng)，因此含有酪氨酸的蛋白質(zhì)均呈米倫反應(yīng)（5 mg/mL）。,3. 茚三酮反應(yīng)(ninhydrin reaction) ，氨基酸與水合茚三酮(苯丙環(huán)三酮戊烴)作用時(shí)，產(chǎn)生藍(lán)色反應(yīng)，由于蛋白質(zhì)是由許多氨基酸組成的，所以也呈此顏色反應(yīng)。 4. 黃蛋白反應(yīng)，蛋白質(zhì)分子中若存在含有苯環(huán)的氨基酸（如Tyr、Phe等），

17、當(dāng)其與硝酸共熱時(shí)，則呈黃色，再加堿則顏色變?yōu)槌赛S。這一反應(yīng)稱為黃蛋白反應(yīng)。一般蛋白質(zhì)常含有Tyr和Phe殘基，因此這一反應(yīng)是蛋白質(zhì)較為普遍的顏色反應(yīng)。,蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng) II,5. 含硫蛋白質(zhì)的反應(yīng)，如果蛋白質(zhì)分子中含有Cys或Met殘基，當(dāng)與堿及醋酸鉛共熱時(shí)，分解產(chǎn)生的硫遇鉛鹽即產(chǎn)生黑色的硫化鉛沉淀。 6. 色氨酸反應(yīng)，將蛋白質(zhì)溶液與幾滴乙醛酸混合后，再沿器壁慢慢加入濃硫酸，如果蛋白質(zhì)分子側(cè)鏈中有吲哚環(huán)，則兩液層的界面上會(huì)出現(xiàn)紫色環(huán)，這個(gè)反應(yīng)稱為色氨酸反應(yīng)，又稱為乙醛酸反應(yīng)或霍普金（Hopking）反應(yīng)?？捎脕?lái)檢驗(yàn)蛋白質(zhì)或肽的分子中是否有Trp殘基。,蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng) III,蛋白質(zhì)定性定量

18、分析,蛋白質(zhì)的定量測(cè)定,一般說(shuō)來(lái)，動(dòng)物性食品的蛋白質(zhì)含量高于植物性食品，以下幾種食品的蛋白質(zhì)含量大約為： 牛肉 20.0% 豬肉 9.5% 兔肉 21% 雞肉 20% 牛乳 3.5% 帶魚 18.0% 大豆 40% 面粉 9.9% 菠菜 2.4% 黃瓜 1.0% 蘋果 1.4% 測(cè)定食品中的蛋白質(zhì)的含量，對(duì)于評(píng)價(jià)食品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、合理開發(fā)利用食品資源、提高產(chǎn)品質(zhì)量、優(yōu)化食品配方、指導(dǎo)經(jīng)濟(jì)核算及生產(chǎn)過程控制均具有極其重要的意義。,蛋白質(zhì)分子量的測(cè)定方法,超離心法 凝膠過濾 SDSPAGE法 光散射法 滲透壓法 激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(LDI-TOF-MS),1、根據(jù)化學(xué)組成測(cè)定最低分子量,用化學(xué)

19、分析方法測(cè)出蛋白質(zhì)中某一微量元素的含量，并假設(shè)分子中只有一個(gè)這種元素的原子，就可以計(jì)算出蛋白質(zhì)的最低分子量。 如肌紅蛋白含鐵0.335%，其最低分子量：最低分子量鐵的原子量鐵的百分含量100=16700與其他方法測(cè)定結(jié)果極為接近，可見肌紅蛋白中只含一個(gè)鐵原子。真實(shí)分子量是最低原子量的n倍，n是蛋白質(zhì)中鐵原子的數(shù)目，肌紅蛋白n1。 血紅蛋白鐵含量也是0.335%，最低分子量也是16700，因?yàn)楹?個(gè)鐵原子，所以n4，因此其真實(shí)分子量為66800。 有時(shí)蛋白質(zhì)分子中某種氨基酸含量很少，也可用這種方法計(jì)算最低分子量。如牛血清白蛋白含色氨酸0.58%，最低分子量為35200，用其他方法測(cè)得分子量為69

20、000，所以其分子中含兩個(gè)色氨酸。最低分子量只有與其他方法配合才能確定真實(shí)分子量。,2、滲透壓法,理想溶液中，滲透壓是濃度的線性函數(shù)，而與溶質(zhì)的形狀無(wú)關(guān)。所以可用滲透壓計(jì)算蛋白質(zhì)的分子量。但是實(shí)際的高分子溶液與理想溶液有較大偏差，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)濃度不大時(shí)，可用以下公式計(jì)算： /c =RT/M + Kc M=RT/lim( /c) 其中R是氣體常數(shù)(0.082)，T是絕對(duì)溫度， 是滲透壓（以大氣壓計(jì)），c溶質(zhì)濃度（g/L）。測(cè)定時(shí)需測(cè)定幾個(gè)不同濃度的滲透壓，以/c對(duì)c作圖并外推求出c為零時(shí)的/c值，帶入公式求出分子量（1-100000）。 方法簡(jiǎn)單準(zhǔn)確，與蛋白質(zhì)的形狀和水化程度無(wú)關(guān)，但要求樣品均一，否

21、則測(cè)定結(jié)果是樣品中各種蛋白的平均分子量。,c0,3、沉降分析法,蛋白質(zhì)在溶液中受到強(qiáng)大離心力作用時(shí)，如其密度大于溶液密度，就會(huì)沉降。用超速離心機(jī)（每分鐘68萬(wàn)轉(zhuǎn)）測(cè)定蛋白質(zhì)的分子量有兩種方法：沉降速度法和沉降平衡法。,沉降速度法： M=RTsD (1v)其中D是擴(kuò)散系數(shù)，v是蛋白質(zhì)的偏微分比容，是溶劑的密度。偏微分比容的定義是：當(dāng)加入1克干物質(zhì)于無(wú)限大體積的溶劑中時(shí)，溶液的體積增量。蛋白質(zhì)溶于水的偏微分比容約為0.74立方厘米每克。為獲得準(zhǔn)確結(jié)果，s和D的值應(yīng)外推到無(wú)限稀釋。其中的R是氣體常數(shù)，在采用厘米.克.秒制時(shí)，等于8.314107爾格/秒。,沉降平衡法 在離心過程中，外圍高濃度區(qū)的蛋白

22、質(zhì)向中心擴(kuò)散，如轉(zhuǎn)速較低，二者可達(dá)到穩(wěn)定平衡。此時(shí)測(cè)定離心管中不同區(qū)域的蛋白濃度，可按下式計(jì)算分子量： M=2RTln(c2/c1)2(1v)(x22x12)其中c2和c1是離軸心距離為x2和x1時(shí)的蛋白質(zhì)濃度，x為蛋白質(zhì)界面到旋轉(zhuǎn)中心的距離，為溶劑的密度，為角速度，v為蛋白質(zhì)的偏微比容。沉降平衡法的優(yōu)點(diǎn)是不需要擴(kuò)散系數(shù)，且離心速度較低（800020000轉(zhuǎn)每分），但要達(dá)到平衡常常需要幾天時(shí)間。,4、分子排阻層析法,層析柱中填充凝膠顆粒，凝膠的網(wǎng)格大小可通過交聯(lián)劑含量控制。小分子物質(zhì)可進(jìn)入網(wǎng)格中，流出慢；大分子被排阻在顆粒外，流經(jīng)距離短，流出快。此方法較簡(jiǎn)單，但與分子形狀有關(guān)。測(cè)分子量時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)

23、蛋白的分子形狀應(yīng)與待測(cè)蛋白相同。 lgMK1K2 Ve其中Ve是洗脫體積，即從加樣到出峰時(shí)流出的體積，K1和K2是常數(shù)，隨實(shí)驗(yàn)條件而定。先測(cè)定幾種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的Ve, 以它們的logM對(duì)Ve作圖得標(biāo)準(zhǔn)曲線，由待測(cè)樣品的Ve可求得。,5、 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳,蛋白質(zhì)電泳時(shí)的遷移率與其所帶凈電荷、分子大小和形狀有關(guān)，加入SDS后，每克蛋白可結(jié)合1.4克SDS，將原有電荷掩蓋，而且使分子變成棒狀。由于凝膠的分子篩效應(yīng)，相對(duì)遷移率R與分子量有如下關(guān)系： lgM=K1K2R其中K1和K2是與試驗(yàn)條件有關(guān)的常數(shù)，R為相對(duì)遷移率=樣品遷移距離/染料前沿遷移距離。用已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白作標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可求出

24、未知蛋白的分子量。有些蛋白不適宜采用這個(gè)方法，如帶電荷較多的（組蛋白），帶較大輔基的（糖蛋白），結(jié)構(gòu)特殊的（膠原）等。,6、激光解吸電離飛行時(shí)間曲線(LDI-TOF-MS),高度純化的蛋白質(zhì)樣品與有機(jī)酸混合，在靶金屬表面干燥； 激光發(fā)出的射線使蛋白質(zhì)離子化，離子經(jīng)加速后飛入自由漂移區(qū)，最后到達(dá)檢測(cè)器； 飛行時(shí)間與分子量成反比，與電量成正比； 測(cè)定誤差0.0001。,蛋白質(zhì)的定量測(cè)定法,凱（克）氏(Kjeldahl)定氮法: 濃硫酸加熱降解蛋白質(zhì)后測(cè)定NH3 雙縮脲(biuret)法: CuSO4與肽鏈的氨基結(jié)合 Folin-Phenol法: 芳香族氨基酸側(cè)鏈發(fā)色 紫外法: 280 nm處的紫外

25、吸收 (1 OD280 = 1 mg/ml) Bradford法: 考馬斯亮蘭 ( Coomassie brilliant blue G250)與肽鏈結(jié)合后吸收譜變化 BCA (bicinchoninic acid)法: FDA唯一認(rèn)可,凱（克）氏定氮法,蛋白質(zhì)的含氮量一般為15-17%，有上下浮動(dòng)的差別，可以測(cè)出總氮(N) = N6.25 = 蛋白質(zhì)含量 1833年，由Kieldhl提出定氮法，現(xiàn)已發(fā)展為常量、微量、自動(dòng)定氮儀法，半微量法及改良凱氏法。,常量凱氏定氮法,原理：樣品與濃硫酸和催化劑一同加熱消化，使蛋白質(zhì)分解，其中碳和氫被氧化為二氧化碳和水逸出，而樣品中的有機(jī)氮轉(zhuǎn)化為氨，與硫酸結(jié)

26、合成硫酸銨；然后加堿蒸餾，使氨蒸出。 用H3BO3吸收后再以標(biāo)準(zhǔn)HCl溶液滴定。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)酸消耗量可以計(jì)算出蛋白質(zhì)的含量。 也可以用過量的標(biāo)準(zhǔn)H2SO4或標(biāo)準(zhǔn)HCl溶液吸收后再以標(biāo)準(zhǔn)NaOH滴定過量的酸。 整個(gè)過程分為：消化、蒸餾、吸收與滴定。,微量凱氏定氮法,1、原理及適用范圍同前 2、與常量法不同點(diǎn)： 加入硼酸量由50 ml 10 ml, 滴定用鹽酸濃度由0.1 mol/L 0.01 mol/L , 可用微量滴定管。,微量凱氏定氮蒸餾裝置,自動(dòng)凱氏定氮法,原理及適用范圍同前 特點(diǎn)： （1）消化裝置用優(yōu)質(zhì)玻璃制成的凱氏消化瓶，紅外線加熱的消化爐。 （2）快速：一次可同時(shí)消化8個(gè)樣品，30分鐘可

27、消化完畢。 （3）自動(dòng)：自動(dòng)加堿蒸餾，自動(dòng)吸收和滴定，自動(dòng)數(shù)字顯示裝置?？捎?jì)算總氮百分含量并記錄，12分鐘完成1個(gè)樣品的測(cè)定。,1.測(cè)定范圍：0.1-200 mg氮 2.蒸餾時(shí)間：3.5分鐘/樣品（30 mg氮）3.蒸餾能力：40 ml/分鐘4.滴定精度：3.8 ul/步，最快40 ml/分鐘5.重現(xiàn)性：1%相對(duì)誤差（包括消化過程）6.回收率：99.5% （1-200 mg 氮）7.數(shù)據(jù)存儲(chǔ)：400個(gè)樣品8.試管排空：200 ml在2秒內(nèi)完成9.試劑泵體積：0-150 ml，10 ml/級(jí),Kjeltec 2300 自動(dòng)凱氏定氮儀 丹麥,雙縮脲法測(cè)定蛋白質(zhì)含量,蛋白質(zhì)含有兩個(gè)以上的肽鍵，因此有

28、雙縮脲反應(yīng)。在堿性溶液中蛋白質(zhì)與Cu2形成紫紅色絡(luò)合物，其顏色的深淺與蛋白質(zhì)的濃度成正比，而與蛋白質(zhì)的分子量及氨基酸成分無(wú)關(guān)，因此被廣泛地應(yīng)用。 在一定的實(shí)驗(yàn)條件下，未知樣品的溶液與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液同時(shí)反應(yīng)，并于540-560 nm下比色測(cè)定光密度（OD或A），可以通過標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線求出未知樣品的蛋白質(zhì)濃度。標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液可以用結(jié)晶的牛（或人）血清清蛋白、卵清蛋白或粉末配制。,雙縮脲法,原理：脲（尿素）NH2CONH2 加熱至150160時(shí)，兩分子縮合成雙縮脲。 雙縮脲能與堿性硫酸銅溶液生成紫紅（或藍(lán)紫）色絡(luò)和物，這種反應(yīng)叫雙縮脲反應(yīng)。（縮二脲反應(yīng)）蛋白質(zhì)分子中含有肽鍵 CONH，與雙縮脲

29、結(jié)構(gòu)相似。在同樣條件下也有呈色反應(yīng)，在一定范圍內(nèi)，其顏色深淺與蛋白質(zhì)含量成正比，可用分光光度計(jì)來(lái)測(cè)其吸光度，確定含量（560 nm） 。,雙縮脲的形成及與堿性銅顯色,Folin-酚法測(cè)定蛋白質(zhì)含量,Folin-酚試劑法包括兩步反應(yīng)：第一步是在堿性條件下，蛋白質(zhì)與銅作用生成蛋白質(zhì)-銅絡(luò)合物；第二步是此絡(luò)合物將磷鉬酸-磷鎢酸試劑（Folin 酚試劑）還原，產(chǎn)生深藍(lán)色（磷鉬藍(lán)和磷鎢藍(lán)混合物），顏色深淺與蛋白質(zhì)含量成正比。此法操作簡(jiǎn)便，靈敏度比雙縮脲法高100 倍，定量范圍為5-100g 蛋白質(zhì)。Folin 試劑顯色反應(yīng)由酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸引起，因此樣品中若含有酚類、檸檬酸和巰基化合物均有干擾作

30、用。此外，不同蛋白質(zhì)因酪氨酸、色氨酸含量不同而使顯色強(qiáng)度稍有不同。也稱改良Lowry法。,紫外吸收法測(cè)定蛋白質(zhì)含量,大多數(shù)蛋白質(zhì)由于有Trp和Tyr的存在，在紫外280 nm有吸收高峰，以此可以進(jìn)行蛋白質(zhì)含量的測(cè)定。 通常以濃度1 mg蛋白質(zhì)/ml溶液的A280為1.0進(jìn)行估算。若已知該蛋白質(zhì)的文獻(xiàn)值，可直接計(jì)算出樣品溶液中蛋白質(zhì)的濃度。 蛋白質(zhì)濃度(mg/m1)=1.45 A280-0.74 A260 (假設(shè)1mg蛋白質(zhì)/ml溶液的A280為1.0) 蛋白質(zhì)含量（mg/ml）=1.55 A280-0.76 A260 215 nm和225 nm的吸收差法，蛋白質(zhì)的肽鍵在200-250 nm有強(qiáng)

31、的紫外光吸收，其光吸收強(qiáng)弱在一定范圍內(nèi)與濃度成正比，且波長(zhǎng)越短光吸收越強(qiáng)。蛋白質(zhì)濃度(mg/ml)=0.144(A215-A225) (測(cè)定范圍為20-100g蛋白質(zhì)/ml),蛋白質(zhì)紫外吸收定量計(jì)算,光吸收值 A 的Beer-Lambert公式: A = kcl = log (Io/I) = -log T T (透光率,%) = I / Io ; k-消光系數(shù)，c-摩爾濃度， l-樣品池長(zhǎng)度; I-光強(qiáng)度 對(duì)混合蛋白質(zhì)樣品, 1 OD280nm 1 mg/ml 對(duì)特定蛋白質(zhì)的光吸收值的理論值: A280(1 mg/mL) = (5690Nw + 1280Ny + 120 Nc)/M Nw, N

32、y和Nc分別為Trp、Tyr和Cys的數(shù)量, M為分子量 Scopes的經(jīng)驗(yàn)公式: A2051 mg/ml = 27 + 120 (A280/A205) 蛋白質(zhì)也可以下列經(jīng)驗(yàn)公式定量: Protein concentration(ug/ml) = 144 (A215 -A225) 有核酸混入時(shí), 有三種近似計(jì)算法: Protein concentration (mg/ml) = 1.55A280 - 0.76A260 Protein concentration (mg/ml) = (A235 -A280)/2.51 Protein concentration (mg/ml) = 0.813A2

33、30 - 0.0758A260,The Protein Protocols Handbook , by John M.Walker, Humana Press.,BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度,堿性溶液中，蛋白質(zhì)將二價(jià)銅(Cu2+)還原成一價(jià)銅(Cu+ )，后者與測(cè)定試劑中BCA bicinchoninic acid，雙辛丹寧(金雞寧)生成一個(gè)在562 nm處具有最大光吸收的紫色復(fù)合物。復(fù)合物的光吸收強(qiáng)度與蛋白質(zhì)濃度正比。此法測(cè)定范圍100-1200g蛋白質(zhì)/ml。BCA法操作簡(jiǎn)單，靈敏度雖與Folin-酚法相似，但它的試劑十分穩(wěn)定，因此對(duì)時(shí)間控制不需那么嚴(yán)格。顯色后，1h內(nèi)讀A562值無(wú)變化，抗試劑

34、干擾的能力強(qiáng)。,考馬斯亮蘭法測(cè)定蛋白濃度 （Coomassie brilliant blue, CBB）,1976年由Bradford建立的考馬斯亮蘭法-Bradford法，根據(jù)蛋白質(zhì)與CBB結(jié)合的原理設(shè)計(jì)。這種測(cè)定法具有超過其他幾種方法突出的優(yōu)點(diǎn)，得到廣泛的應(yīng)用。是目前靈敏度最高的蛋白質(zhì)測(cè)定法。CBB G-250染料在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合，使染料的最大吸收峰的位置由465 nm變?yōu)?95 nm，溶液的顏色也由棕黑色變?yōu)樘m色。染料主要是與蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸（特別是精氨酸）和芳香族氨基酸殘基相結(jié)合。595 nm下測(cè)定的吸光度值A(chǔ)595，與蛋白質(zhì)濃度成正比。,Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)的優(yōu)缺

35、點(diǎn),優(yōu)點(diǎn)： （1）靈敏度高，最低蛋白質(zhì)檢測(cè)量可達(dá)1 ug。（2）快速、簡(jiǎn)便，只需加一種試劑。 （3）干擾物質(zhì)少。 缺點(diǎn)：（1）由于各種蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白質(zhì)測(cè)定時(shí)有較大的偏差，在制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)通常選用g-球蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，以減少這方面的偏差。（2）仍有一些物質(zhì)干擾此法的測(cè)定，主要的干擾物質(zhì)有：去污劑、 Triton X-100、十二烷基硫酸鈉（SDS）和0.1N的NaOH。 （3）標(biāo)準(zhǔn)曲線也有輕微的非線性，因而不能用Beer定律進(jìn)行計(jì)算，而只能用標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)測(cè)定未知蛋白質(zhì)的濃度。,蛋白質(zhì)的分離純化,蛋白質(zhì)分離純化的一般原則,純化蛋白質(zhì)（酶

36、）的最終目標(biāo)：增加純度或比活性，并使產(chǎn)量達(dá)到最高值。 前處理 （提取） 粗分級(jí) （初提純） 細(xì)分級(jí) （精純化）,蛋白質(zhì)分離純化的基本原則,選擇好的材料 摸清目的蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性 探索有效的抽提法和濃縮法 建立一套層析的組合 以較好的方法貯存,初提 精純化 鹽析 離子交換層析 有機(jī)溶劑沉淀 分子篩層析 等電點(diǎn)沉淀 疏水/反相層析 結(jié)晶 親和層析,蛋白質(zhì)分離純化的具體方法,必須分離和純化蛋白質(zhì),研究蛋白質(zhì)的性質(zhì)、功能、氨基酸組成及序列測(cè)定，必須制備純的蛋白質(zhì)。一個(gè)細(xì)胞含有成千上萬(wàn)種不同的蛋白質(zhì)，如何由其中分離獲得其中的某個(gè)蛋白質(zhì)？ 分離純化蛋白質(zhì)的方法利用了不同蛋白質(zhì)分子之間不同的理化性質(zhì)，如：許多

37、蛋白質(zhì)能高特異性地與其他生物分子結(jié)合，這些蛋白質(zhì)的分離純化就可以利用這一特性。,破碎細(xì)胞及離心,蛋白質(zhì)的來(lái)源通常是生物組織或微生物細(xì)胞。分離純化的第一步是要破碎這些細(xì)胞，將其中的蛋白質(zhì)釋放到溶液中粗提液(crude extract)。如果需要，可以用不同的離心力對(duì)樣品進(jìn)行離心，制備亞細(xì)胞組分或分離特定的細(xì)胞器。細(xì)胞器如核、線粒體、溶酶體等，它們大小不同，離心時(shí)的沉降速度不同，在不同的密度梯度中由于不同的比重，浮沉的位置不同。不同的離心可以獲得不同的組分。,Subcellular Fractionation of Tissue,Fractionation,Isopycnic Centrifuga

38、tion 等密度（梯度）離心,分部分離 (Fractionation ),一旦完成提取物粗抽提或細(xì)胞器的制備，多種方法可以用于純化其中的蛋白質(zhì)。通常，利用蛋白質(zhì)的大小或帶電特性將混合物中的蛋白質(zhì)分離成不同的組分分部分離。早期純化的分部分離利用蛋白質(zhì)的溶解度的不同，其中涉及pH、溫度、鹽濃度及其他因素。通常蛋白質(zhì)在高鹽濃度下的溶解度降低鹽析(salting out)，在蛋白質(zhì)溶液中增加鹽，可以在一些蛋白質(zhì)處于溶解時(shí)選擇性地沉淀一些蛋白質(zhì)。由于高的水溶性，硫酸銨(NH4)2SO4常被用于這一過程。,沉淀蛋白質(zhì)的方法： 鹽析法 有機(jī)溶劑沉淀法 等電點(diǎn)沉淀法 重金屬鹽沉淀法 生物堿試劑和某些酸類沉淀法

39、 加熱變性沉淀法,蛋白質(zhì)混合物的分離方法,利用溶解度差別的分離方法 根據(jù)分子大小不同的分離方法 根據(jù)電荷不同的分離方法 蛋白質(zhì)與其它化合物的專一或非專一相互作用,利用溶解度差別的分離方法,1.等電點(diǎn)沉淀：（isoelectric precipitation） 2. 蛋白質(zhì)的鹽溶（salting in）和鹽析（salting out） 3. 有機(jī)溶劑分級(jí)法 4. 溫度對(duì)蛋白質(zhì)溶解度的影響,根據(jù)分子大小不同的分離方法,透析（dialysis）和超(過)濾（ultrafiltration）： 密度梯度（區(qū)帶）離心： 凝膠過濾層析（分子排阻層析、分子篩層析、凝膠滲透層析） （gel filtratio

40、n，GF） ：,透析（Dialysis）,含有目的蛋白質(zhì)的溶液在進(jìn)一步純化前需作進(jìn)一步的處理，如透析，利用蛋白質(zhì)分子較大的特性將蛋白質(zhì)從溶劑分離。將部分純化的蛋白質(zhì)溶液裝在一個(gè)半透膜的袋子或管子中，當(dāng)裝有樣品的透析袋懸浮于一定離子強(qiáng)度的大體積的緩沖液（透析液）中，半透膜允許鹽及緩沖液發(fā)生交換，但蛋白質(zhì)不能透過，這樣蛋白質(zhì)樣品被保留在袋或管內(nèi)，樣品中的鹽或其它溶質(zhì)可以透過膜進(jìn)行動(dòng)態(tài)平衡交換，多次調(diào)換透析液可使樣品中的多數(shù)鹽被稀釋。常被用于去除蛋白質(zhì)樣品中的硫酸銨脫鹽（去鹽）。,透析（dialysis）,超 濾（Ultrafiltration),利用超濾膜在壓力下使大分子滯留，而小分子及溶劑濾過的

41、方法叫超濾。 超濾法在蛋白質(zhì)溶液除鹽、濃縮及分離純化中有廣泛的應(yīng)用。,超速離心（Ultracentrifugation）,不同蛋白質(zhì)的密度與形態(tài)各不相同，在離心力場(chǎng)中沉降的速度也不同，從而將其分離。 蛋白質(zhì)在離心場(chǎng)中的行為用沉降系數(shù)（S）表示。 大體上S與蛋白質(zhì)分子量成正比關(guān)系。 S與蛋白質(zhì)的密度和形狀相關(guān)，如分子量相同，緊密顆粒的摩擦系數(shù)小沉降快；而疏松顆粒的摩擦系數(shù)大沉降慢。 應(yīng)用：蛋白質(zhì)的分離純化和分子量測(cè)定。,Ultracentrifugation,蛋白質(zhì)的分離與分析 -層析(Chromatography),蛋白質(zhì)分離純化中常用的層析,分子篩層析 離子交換層析 疏水/反相層析 親和層析

42、 物理吸附層析,利用分子量差異,利用電荷差異,利用親疏性差異,利用特異性親和,利用非特異性吸附,什么是層析-chromatography,March 21, 1903, Meeting of the Warsaw Society of Natural Scientists, Mikhail Semenovich Tswett presented a lecture entitled On a New Category of Adsorption Phenomena and its Application in Biochemical Analysis., , ,Martin & Synge的逆

43、流分配模型,K=1/3,K=2/3,1952年獲獎(jiǎng),如陽(yáng)離子交換層析，固體填料上帶負(fù)電荷，流動(dòng)相中帶凈正電荷的蛋白質(zhì)與帶凈負(fù)電荷的蛋白質(zhì)相比流得更慢，前者因?yàn)榕c固定相電荷的作用受到更大的阻滯。兩種不同類型的蛋白質(zhì)可以被分離成明顯的兩個(gè)帶。蛋白質(zhì)樣品在流動(dòng)相中的擴(kuò)展受到分離蛋白質(zhì)不同性質(zhì)的影響及擴(kuò)散的影響。當(dāng)柱長(zhǎng)增加時(shí)，帶有不同凈電荷的兩類蛋白質(zhì)的分辨率增加。然而柱長(zhǎng)增加通常會(huì)引起樣品流速的降低，樣品流經(jīng)柱的時(shí)間長(zhǎng)度增加，擴(kuò)散作用會(huì)引起分辨率的下降。,離子交換層析,離子交換層析原理,分子排阻層析(size-exclusion chromatography)，也稱凝膠過濾(gel filtrati

44、on)，根據(jù)蛋白質(zhì)分子的大小進(jìn)行分離。柱料是具有特定孔徑大小的交聯(lián)聚合物。由于較大分子的蛋白質(zhì)不能進(jìn)入柱料的微孔內(nèi)部，流經(jīng)柱的直接路徑短，因而比較小分子蛋白質(zhì)的移動(dòng)速度快而先被洗脫出來(lái)；較小分子的蛋白質(zhì)進(jìn)入微孔內(nèi)部，因相對(duì)較長(zhǎng)的流經(jīng)距離而移動(dòng)得慢而后被洗脫。,Gel filtration chromatography,親和層析(affinity chromatography)，根據(jù)蛋白質(zhì)分子的結(jié)合特性分離蛋白質(zhì)。滯留在柱料上的蛋白質(zhì)是能特異性與柱料表面交聯(lián)的配體結(jié)合的蛋白質(zhì)。非結(jié)合的蛋白質(zhì)在平衡過程被洗掉，結(jié)合到柱上的目的蛋白質(zhì)用含有游離配體的溶液洗脫下來(lái)。,親和層析需要有共價(jià)交聯(lián)在層析填料上

45、的生物配體，交聯(lián)的配體必需與目標(biāo)分子間有特異性的親和結(jié)合。非結(jié)合分子被洗去后，結(jié)合在配體上的生物分子必需是可逆的，被競(jìng)爭(zhēng)洗脫后保持生物活性。,High Performance Liquid Chromatography (HPLC),利用高壓泵，加快蛋白質(zhì)分子沿柱流動(dòng)的速度，提高層析效果，縮短層析時(shí)間，消除擴(kuò)散影響，提高分辨率。,HPLC層析系統(tǒng),泵的結(jié)構(gòu),實(shí)驗(yàn)室用層析柱,工業(yè)用層析柱, 0.5-5 cm, 5-100 cm,填充物的多孔化可以減少層析壓,灌注層析示意,根據(jù)蛋白質(zhì)表面疏水性的不同，利用蛋白質(zhì)和疏水層析介質(zhì)疏水表面可逆的相互作用分離蛋白質(zhì)。 雖然科學(xué)文獻(xiàn)中有些建議，但到目前為止，

46、還沒有被廣泛接受的關(guān)于疏水相互作用層析機(jī)制的理論。,疏水相互作用層析（Hydrophobic interaction chromatography, HIC）,反相層析（Reverse Phase Chromatography, RPC）,依賴于洗脫液中樣品分子與介質(zhì)可逆的相互作用。起始條件主要是水相的，有利于高度有序的水結(jié)構(gòu)圍繞著樣品分子。通常一小部分有有機(jī)修飾，常用3-5%的乙腈來(lái)“造成”濕表面。樣品結(jié)合到填料上，暴露給洗脫液的疏水區(qū)域被最小化，分離依賴于樣品分子在洗脫液中和填料表面達(dá)到的平衡。樣品的分布依賴于填料的性質(zhì)、樣品的疏水性和洗脫液的組成（流動(dòng)相）。,純化工藝中不同層析技術(shù)的組合

47、,一般準(zhǔn)則: 結(jié)合互補(bǔ)選擇性的技術(shù)，純化工藝應(yīng)盡量采用不同層析技術(shù)(e.g. IEX, HIC and GF) 減少不同層析技術(shù)間的樣品處理(e.g. 濃縮, 交換緩沖液) 盡量簡(jiǎn)單,附:Classification of Chromatography,通常一個(gè)特定蛋白質(zhì)的分離純化會(huì)用到幾種不同手段的組合，每種方法的選擇也是經(jīng)驗(yàn)性的，在最終確定最有效的方法前需要進(jìn)行多種方法及其組合的嘗試。一般情況會(huì)出現(xiàn)以下不同方法的試驗(yàn)和最終組合。,蛋白質(zhì)的分離與分析 -電泳 (Electrophoresis),蛋白質(zhì)可以通過電泳分離和鑒定,分離蛋白質(zhì)的一個(gè)重要技術(shù)（手段）是電泳，利用帶電蛋白質(zhì)在電場(chǎng)中受電場(chǎng)

48、力作用發(fā)生遷移的特性電泳。電泳通常不用于大規(guī)模的蛋白質(zhì)純化，因?yàn)橛懈?jiǎn)單的方法可用，并且電泳會(huì)不可逆地導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的改變。電泳在蛋白質(zhì)及核酸等的分析方法上特別有用。優(yōu)點(diǎn)是蛋白質(zhì)經(jīng)電泳分離后可以顯色，研究人員可以很快估測(cè)不同蛋白質(zhì)在混合物中的數(shù)量或制備的蛋白質(zhì)的純度；電泳還可以用于測(cè)定蛋白質(zhì)的一些性質(zhì)，如等電點(diǎn)及大概的分子量。,蛋白質(zhì)的電泳通常在交聯(lián)的多聚物凝膠（如聚丙烯酰胺凝膠）上進(jìn)行。聚丙烯酰胺凝膠起著分子篩的作用，能減緩電荷/質(zhì)量比相近蛋白質(zhì)的遷移。待分離物質(zhì)的遷移可能還受分子形狀的影響。電泳中，驅(qū)動(dòng)大分子運(yùn)動(dòng)的力是電勢(shì)梯度-E（場(chǎng)強(qiáng)）。分子的電泳遷移率等于粒子的電壓與電場(chǎng)場(chǎng)強(qiáng)的比

49、值，還等于分子的凈電荷Z與摩擦系數(shù)f (frictional coefficient)（部分反映蛋白質(zhì)分子的形狀）的比值。 =V/E=Z/f 因此，蛋白質(zhì)在電場(chǎng)中的電泳遷移是大小和形狀的作用結(jié)果。,E. coli RNA Pol.,電泳現(xiàn)象早在1809年就已發(fā)現(xiàn)，用于蛋白質(zhì)電泳也有100多年的歷史（1907年）。1937年瑞典的Tiselius因?qū)﹄娪径糠矫娴呢暙I(xiàn)而獲得諾貝爾獎(jiǎng)。以后瓊脂電泳和紙電泳技術(shù)進(jìn)一步發(fā)展，并與醫(yī)學(xué)廣泛結(jié)合。在20世紀(jì)60年代凝膠電泳的興起，樹立了電泳史上的一個(gè)里程碑，蛋白質(zhì)電泳普及到生物學(xué)和醫(yī)學(xué)的大部分實(shí)驗(yàn)室。30多年前，現(xiàn)代雙向電泳的出現(xiàn)，奠定了目前蓬勃發(fā)展的蛋白

50、質(zhì)組學(xué)的基礎(chǔ)；20年前，商品化的毛細(xì)管電泳突飛猛進(jìn)的發(fā)展，使電泳操作實(shí)現(xiàn)了自動(dòng)化。,1708年Reuss的實(shí)驗(yàn),1930年Tiselius的裝置,最早的電泳裝置-移界(自由)電泳,1948年分離血清蛋白的工作獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)，成功將血清蛋白分成5個(gè)主要成分-清蛋白、1-、2-、-和-球蛋白。,幾種常用的電泳,紙電泳 瓊脂電泳 聚丙烯酰胺凝膠電泳 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳 等電聚焦電泳 OFarrell的雙向電泳 毛細(xì)管電泳,紙電泳 (Paper Electrophoresis),在滲透了緩沖液的濾紙上加上電場(chǎng)，使物質(zhì)移動(dòng)的電泳法。也就是把樣品以帶狀加在作為支持體的濾紙內(nèi)來(lái)檢測(cè)其移動(dòng)和分離的方

51、法。常用以分離性質(zhì)相似的物質(zhì)，如各種氨基酸的分離和稀土元素的分離等。 紙電泳可分為低壓電泳和高壓電泳兩類。低壓電泳的電壓一般在100-500 V，電流為 0-150 mA，高壓電泳的電壓一般在500-10 000 V，50-400 mA。,紙電泳的儀器裝置包括電泳槽及電泳儀兩大部分。 電泳槽是進(jìn)行電泳的裝置，其中包括鉑電極(直徑0.5-0.8 cm)、緩沖液槽、電泳介質(zhì)的支架和一個(gè)透明的罩。常見的電泳槽有水平式和懸架式等。電泳儀是提供直流電源的裝置，它能控制電壓和電流的輸出。電泳槽內(nèi)的鉑電極經(jīng)隔離導(dǎo)線穿過槽壁與外接電泳儀電源相連，電源為具有穩(wěn)壓器的直流電源。,瓊脂糖凝膠電泳（Agarose G

52、el Electrophoresis）,瓊脂糖是從瓊脂中提純出來(lái)的，主要是由D半乳糖和3,6脫水L半乳糖連接而成的一種線性多糖。瓊脂糖凝膠的制作是將干的瓊脂糖懸浮于緩沖液中，通常使用的濃度是13，加熱煮沸至溶液變?yōu)槌吻?，注入模板后室溫下冷卻凝聚即成瓊脂糖凝膠。主要在DNA制備電泳中作為一種固體支持基質(zhì)。瓊脂糖之間以分子內(nèi)和分子間氫鍵形成較為穩(wěn)定的交聯(lián)結(jié)構(gòu)，這種交聯(lián)的結(jié)構(gòu)使瓊脂糖凝膠有較好的抗對(duì)流性質(zhì)。瓊脂糖凝膠的孔徑可以通過瓊脂糖的最初濃度來(lái)控制，低濃度的瓊脂糖形成較大的孔徑，而高濃度的瓊脂糖形成較小的孔徑。,水平式電泳,聚丙烯酰胺凝膠電泳(Polyacrylamide Gel Electro

53、phoresis, PAGE),聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺單體(Acrylamide, Acr)和交聯(lián)劑N1, N1-甲叉雙丙烯酰胺(N, N-methylene bisacrylamide, Bis)在催化劑的作用下聚合而成的含酰胺基側(cè)鏈的脂肪族長(zhǎng)鏈，相鄰的兩個(gè)鏈通過甲叉橋交鏈起來(lái)，鏈縱橫交錯(cuò)，形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠。參與反應(yīng)的催化劑有二種成分。一是引發(fā)劑，它提供原始自由基，通過自由基傳遞，使丙烯酰胺成為自由基，發(fā)動(dòng)聚合反應(yīng)；二是加速劑，它加快引發(fā)劑釋放自由基速度。過硫酸銨和核黃素分別引發(fā)二種不同類型的反應(yīng)。,單體：丙烯酰胺，甲叉雙丙烯酰胺,聚合反應(yīng)催化劑的搭配,TEMED: N, N, N

54、1, N1-tetramethylethylenediamine N,N,N1,N1-四甲基乙二胺 DMAPN: 3-dimethylaminpropionitrile，3-二甲基氨丙腈,化學(xué)聚合：過硫酸銨在TEMED或DMAPN的催化下形成氧自由基，進(jìn)而使單體形成自由基，引發(fā)聚合反應(yīng)。聚丙烯酰胺凝胺的分離膠(小孔膠)，就是通過這種化學(xué)聚合而合成的。 光聚合：核黃素在光下形成無(wú)色基，后者被氧再氧化形成自由基，從而引發(fā)聚合反應(yīng)。但過量的氧會(huì)阻止鏈長(zhǎng)的增加。此法比上法制得凝膠的膠孔大，因此常作電泳中的濃縮膠。,凝膠濃度和交聯(lián)度與孔徑大小的關(guān)系,為了使樣品分離得快，操作方便，便于記錄結(jié)果和保存樣本，

55、要求凝膠有一定的物理性質(zhì)，合適的篩孔、一定的機(jī)械強(qiáng)度、良好的透明度。這些性質(zhì)很大程度上是由凝膠濃度和交聯(lián)度所決定的。 100 ml凝膠溶液中含有的單體和交聯(lián)劑總克數(shù)稱為凝膠濃度，記號(hào)為T。 T (%) Acr (g) + Bis (g) / V (ml) 100% 凝膠溶液中，交聯(lián)劑占單體加交聯(lián)劑總量的百分?jǐn)?shù)為交聯(lián)度，記號(hào)為C。 C (%) Bis /(Acr + Bis)100%,凝膠濃度和交聯(lián)度與孔徑大小的關(guān)系,凝膠濃度能夠在3-30%中變化，濃度過高時(shí)，凝膠硬而脆，容易破碎；濃度太小，凝膠稀軟，不易操作。凝膠濃度主要影響篩孔的大小，篩孔的平均直徑和凝膠濃度的平方根成反比。 T5%，網(wǎng)孔的

56、平均直徑為1.55A/5%1/2 33.5 A T7%，網(wǎng)孔的平均直徑為1.55A/7%1/2 28.3 A 交聯(lián)度C反映凝膠結(jié)構(gòu)中甲撐橋的密度。交聯(lián)過高，凝膠是不透明的，并且缺乏彈性；交聯(lián)過低，呈糜糊狀。交聯(lián)度可以決定篩孔的最大直徑。,分子量范圍與凝膠濃度的關(guān)系,聚丙烯酰胺凝膠有下列特性： (1)在一定濃度時(shí)，凝膠透明，有彈性，機(jī)械性能好； (2)化學(xué)性能穩(wěn)定，與被分離物不反應(yīng)，很多溶劑中不溶； (3)對(duì)pH和溫度變化較穩(wěn)定； (4)幾乎無(wú)吸附和電滲作用，只要Acr純度高，操作條件一致，則樣品分離重復(fù)性好； (5)樣品不易擴(kuò)散，且用量少，其靈敏度可達(dá)10-6g （1 g） (6)凝膠孔徑可調(diào)

57、節(jié)，根據(jù)被分離物的分子量選擇合適的濃度，通過改變單體及交聯(lián)劑的濃度調(diào)節(jié)凝膠的孔徑。,圓盤電泳(Disc Electrophoresis),正面,剖面,夾心垂直板電泳槽示意圖,SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis, SDS-PAGE),蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠電泳時(shí)，它的遷移率取決于它所帶凈電荷以及分子的大小和形狀等因素。如果在丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中加入陰離子去污劑十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate, 簡(jiǎn)稱SDS)，則蛋白質(zhì)分子的電泳遷移率主要取決于它的分子量，而與所帶電荷和形狀無(wú)關(guān)。因此可以利用SDS-PA

58、GE測(cè)定蛋白質(zhì)分子量。,樣品和濃縮膠中含 Tris-HCl (pH 6.8), 上下槽緩沖液含Tris-甘氨酸(pH 8.3), 分離膠中含Tris-HCl (pH 8.8)。系統(tǒng)中所有組分都含有0.1% 的 SDS (Laemmli, 1970)。,SDS的作用,SDS通過疏水作用與蛋白質(zhì)結(jié)合，結(jié)合的數(shù)量與蛋白質(zhì)的分子量成比例，一個(gè)SDS分子平均結(jié)合兩個(gè)氨基酸殘基，使得蛋白質(zhì)分子帶凈負(fù)電荷，并具有幾乎相同的電荷/質(zhì)量比。SDS結(jié)合引起蛋白質(zhì)構(gòu)象的改變，SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物的流體力學(xué)和光學(xué)性質(zhì)表明，它們?cè)谒芤褐械男螤罱朴谘┣褵熜螤畹拈L(zhǎng)橢園棒，不同蛋白質(zhì)的SDS復(fù)合物的短軸長(zhǎng)度都一樣，而長(zhǎng)軸

59、則隨蛋白質(zhì)分子量成正比地變化。這樣的SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物，在凝膠電泳中的遷移率，不再受蛋白質(zhì)原有電荷和形狀的影響。由于SDS和巰基乙醇的作用，蛋白質(zhì)完全變性和解聚，解離成亞基或單個(gè)肽鏈，因此測(cè)定的結(jié)果只是亞基或單條肽鏈的分子量。,連續(xù)系統(tǒng),PAGE根據(jù)其有無(wú)濃縮效應(yīng)，分為連續(xù)系統(tǒng)和不連續(xù)系統(tǒng)兩大類，連續(xù)系統(tǒng)電泳體系中緩沖液pH值及凝膠濃度相同，帶電顆粒在電場(chǎng)作用下，主要靠電荷和分子篩效應(yīng)。,不連續(xù)系統(tǒng),不連續(xù)系統(tǒng)中由于緩沖液離子成分、pH、凝膠濃度及電位梯度的不連續(xù)性，帶電顆粒在電場(chǎng)中泳動(dòng)不僅有電荷效應(yīng)，分子篩效應(yīng)，還具有濃縮效應(yīng)，因而其分離條帶清晰度及分辨率均較前者為好。,不連續(xù)體系,最早由Ornstein(1964) 和Davis(1964) 設(shè)計(jì)，由電極緩沖液、濃縮膠及分離膠所組成。濃縮膠是由AP催化聚合而成的大孔膠，凝膠緩沖液為pH6.7的Tris-HC1。分離膠是由AP催化聚合而