密級 論文編號 中國農業(yè)科學院 學位論文 彩色棉生物化學和分子生物學的初步研究 on on I 摘 要 彩色棉是一種棉纖維天然就具有色澤的棉花類型。近年來，綠色環(huán)境標志已經受到全世界各國的普遍響應和關注。彩色棉由于其加工過程無須人工染色而博得了“綠色衣服”的美譽。 作為一種健康無害、生態(tài)效益高的特種棉，彩色棉具有非常廣闊的市場前景，必將掀起紡織、服裝等行業(yè)的一場革命。本研究以彩色棉為實驗材料，在棉纖維分子生物學和生物化學等方面進行了初步探索。 1. 比較了提取 時比較了對棉花 葉片進行不同處理后提取 為彩色棉分子生物學研究奠定了基礎 。結果表明：兩種方法均獲得了較高質量的 鮮的棉花葉片、在 4 黑暗中饑餓 1天的葉片和在室溫條件下自然干燥 1天的葉片都可以提取到質量滿意的 42 干燥 1至數(shù)天的葉片提取到的 能夠滿足 2. 利用 8個彩色棉品系的 110對 0對擴增效果較好的引物，應用其中的 4對構建了 18個彩色棉的分子檢索模式圖。同時用這 10對引物對 18個彩色棉進行了聚類分析，對它們 的親緣關系作了初步探討。 3. 以棕 263和 用 果表明： 216對 9對在親本間出現(xiàn)差異，在基因池間進一步篩選又得到 2對差異性引物，但它們均不 與棕色纖維基因 緊密 連鎖。 4. 比較了甲醇浸泡、乙醇浸泡后微波加熱、乙醇蒸餾、 醇蒸餾法提取纖維色素的效果，發(fā)現(xiàn)乙醇提取液有明顯的顏色。顯色反應證明：綠色棉乙醇提取液含有黃酮類物質。另外， 醇法提取液的掃描光譜與前人報道的不完全吻合，有待于進一步驗證。對 提取蠟質后發(fā)現(xiàn)，白色棉的蠟質含量明顯低于綠色棉，四個綠色棉的蠟質含量差別較大， 間，并且纖維色澤的深淺與蠟質含量的大小無相關性。 5. 對棕、綠色棉織物進行酸、堿、水、肥皂液和洗衣粉浸洗，洗滌不同次數(shù)，采用不同晾曬方式。色系分析表明，酸能加深彩色棉的色澤，堿能加深棕色棉的色澤，卻降低綠色棉的色澤；水和肥皂的洗滌效果優(yōu)于洗衣粉；陰干效果明顯優(yōu)于曬干。 6. 在霜降之后，對 島棉和 6個彩色棉品種進行了 活性測定，結果表明：有些彩色棉的保護酶活性甚至高于白色棉和 海島棉，因此彩色棉在寒冷脅迫下，保護酶系統(tǒng)代謝旺盛，具備抗寒的潛在能力。另外，三種保護酶的活性在不同彩色棉品種間的變化參差不齊。 7. 以查耳酮合成酶 (查耳酮異構酶 (黃烷酮 3二氫黃酮醇 4苯丙氨酸解氨酶 (分析對象，通過 列比對、 、三級結構分析等步驟，對這些酶的分子結構和功能進行了初步探討， 為進一步確定這些酶基因在棉花基因組中的拷貝數(shù) , 明確這些酶基因在纖維發(fā)育不同階段的表達情況 , 進而 克隆這些酶基因 作了鋪墊。 關鍵詞 : 棉花， 素，蠟質，保護酶 is a of in no by it is is It a in in as on 1. NA in DS on to NA NA be by of In NA if in 2 to NA in it no CR 2. SR 8 SR 10 SR we 0 of to a of 0 of we a on 3. 582 as F2 as we SR to 19 16 SR 2 9 of of 4. of in in in of by of of We no 5. by in . on of of of of of of of in 6. we of of OD of of of of in In of 7. 3H), as ST of of of of 略詞 bp cM 3H S V 目 錄 第一章 引言 . 1 彩色棉的種植簡史及在各國的利用情況 . 1 彩色棉的傳統(tǒng)遺傳學研究 . 2 彩色棉的生物化學和分子生物學研究 . 4 彩色棉的指紋圖譜研究 . 4 彩色棉纖維的生物化學研究 . 5 彩色棉織物的洗曬處理研究 . 6 第二章 棉花基因組 提取 . 8 材料與方法 . 8 實驗材料 . 8 棉花基因組 提取 . 8 對提取的棉花 行檢測 . 9 結果與分析 . 9 瓊脂糖電泳檢測 . 9 紫外分光光度計檢測 . 10 測提取的 . 11 討論 . 12 第三章 彩色棉品系的纖維性狀比較和 紋分析 . 13 材料與方法 . 13 實驗材料 . 13 棉纖維性狀測定和分 析 . 14 棉花葉片 提取 . 14 增 . 14 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 . 14 結果與分析 . 14 不同彩色棉品系的纖維性狀比較 . 14 增產物的多態(tài)性 . 16 18 個彩色棉品系的 紋鑒定 . 17 18 個彩色棉品系的親緣關系分析 . 17 討論 . 19 第四章 棕色纖維基因的 子標記初探 . 20 材料與方法 . 20 實驗材料與化學試劑 . 20 田間棉花色澤分析 . 20 棉花 取和 建池 . 20 微衛(wèi)星（ 物篩選 . 20 數(shù)據(jù)統(tǒng)計 . 21 結果與分析 . 21 棕色棉遺傳的田間調查分析 . 21 增結果 . 21 連鎖分析 . 22 討論 . 22 第五章 彩色棉纖維色素和蠟質研究 . 23 材料與方法 . 23 實驗材料 . 23 纖維色素的提取 . 23 色素提取液的光譜檢測 . 23 色素提取液的顯色反應 . 24 纖維蠟質的提取 . 24 結果與分析 . 24 色素提取液的光譜分析 . 24 色素提取液的顯色分析 . 26 白、棕、綠色棉的纖維素含量比較 . 26 綠色棉的蠟質含量測定 . 27 討論 . 27 第六章 彩色棉洗曬處理的色澤變化分析 . 28 材料與方法 . 28 材料 . 28 方法 . 28 結果與分析 . 28 不同處理彩色棉織物的色調變化 . 28 酸堿對彩色棉織物的影響 . 29 不同洗滌劑液對彩色棉織物的影響 . 30 洗滌次數(shù)對彩色棉織物的影響 . 31 洗滌液溫度對彩色棉織物的影響 . 32 晾曬方式對彩色棉織物的影響 . 33 6. 3 討論 . 33 第七章 不同彩色棉的保護酶活性比較 . 34 材料與方法 . 34 實驗材料 . 34 的提取和酶活測定 . 34 的提取和酶活測定 . 34 的提取和酶活測定 . 35 結果與討論 . 35 八章 色素合成酶的生物信息學淺析 . 37 分析步驟 . 37 結果與分析 . 38 討論 . 40 第九章 結 論 . 41 參考文獻 . 45 致 謝 . 47 作者簡介 . 48 中國農業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 引言 1 第一章 引 言 彩色棉的種植簡史及在各國的利用情況 彩色棉即有色棉，是一種纖維中含有色素類物質的特殊類型的棉花。據(jù)考證，四千多年前的古印第安人已經開始種植彩色棉了。早在公元前，墨西哥的烏雅族和阿西德族人也開始栽培彩色棉花了，當西班牙人 16 世紀進入墨西哥南部和尤卡坦半島時，當?shù)氐闹裁迾I(yè)已經很發(fā)達，島上的居民將彩色棉紡成土布，制成民族服裝在集市上出售。據(jù)秘魯史料記載，很久以前在 秘魯莫奇卡地區(qū)北部就有人種植彩色棉了，后來由于天災人禍，彩棉失傳了。然而， 1988 年人們在一座古代莫奇卡人墓穴的殉葬品中又發(fā)現(xiàn)了彩棉種子，經過發(fā)芽試驗，這些彩棉種子竟奇跡般地發(fā)芽、生長、吐絮，最終長成灰白、紅黃和棕色三種顏色的彩棉。我國也堪稱一個種植彩色棉的古國。在十八、十九世紀，江浙一帶廣泛種植著一種紫黃色絮的棉花品種，其紡織出來的布就是著名的“紫花布”，曾遠銷歐美，倍受青睞。在今天的英國倫敦博物館里，我們還可以看到當年用紫花布制成的英國紳士的時髦服裝。 十九世紀中葉，歐洲工業(yè)革命的到來帶動了紡織工業(yè)和印 染工業(yè)的的飛速發(fā)展，與此同時，人們經過長期的選擇育種，逐漸培育出了性狀穩(wěn)定的白色棉花。于是，運用先進的印染技術，由白色棉花紡成的布料也可以變得綺麗多彩。相比之下，天然彩色棉由于顏色單調且不穩(wěn)定、纖維品質差和產量低等缺點而遭受人們的冷落。 二十世紀末，健康理念和環(huán)保理念逐漸深入人心，世界范圍內掀起了一股綠色消費的熱潮，這時，彩色棉的開發(fā)和利用才重現(xiàn)曙光。據(jù)報道，在白色原棉的加工過程中，運用了 300 多種化學物質，制成的衣服中可能殘留著偶氮染料、甲醛、重金屬等多種對人體有害的物質，另外，工業(yè)廢水中含有 眾多重金屬，對自然環(huán)境造成了嚴重的污染。然而，彩色棉恰恰由于其加工過程無須人工染色而博得了“綠色衣服”的美譽。近年來，綠色環(huán)境標志已受到全世界各國的普遍響應和關注。西方發(fā)達國家首先制定了“綠色標準”、“環(huán)境價值含量”、“紡織有害化學物質限量指標”；國際標準化組織（ 1996 年已正式將 4000 認證體系作為國際標準，即紡織品和服裝要通過環(huán)保認證，才允許進入國際市場。從 1996 年到 2000 年，全世界獲得 4000 認證的企業(yè)數(shù)量以每年 2的速度遞增?，F(xiàn)在，彩棉衣服正緊 跟世界服裝市場的潮流，已經成為消費的一個熱點，具有非常廣闊的前景，眾多國家也不約而同地將目光匯聚于此。 目前，美國的彩棉生產和科研水平處于世界領先地位。 1988 年，得克薩斯州棉花研究中心的兩位棉花育種專家，已經開始專門從事彩棉的育種工作； 1992 年，彩棉的規(guī)模生產和市場銷售開始啟動，并將培育出來的棕色棉和綠色棉進行了登記注冊；到 1994 年，美國生產的彩棉、原棉已達 2 萬噸，占全美國棉花產量的 1。雖然后來受到了種植白色棉花的棉農們的強烈抵制，并一度處于停滯狀態(tài)，但美國彩棉產業(yè)在世界棉業(yè)的領先地位仍未動搖。 我 國是繼美國之后世界上第二個彩棉生產大國， 1997 年，我國種植彩棉 6000 多畝，截止到 2001年，我國彩棉種植面積已超過 6 萬畝。中國農業(yè)科學院棉花研究所自 1987 年以來，采用遠緣雜交、系譜選擇等綜合育種技術，培育出了棕絮 1 號、綠絮 1 號、棕 2 1 3彩棉新材中國農業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 引言 2 料和新品系，它們促成了我國第一批彩棉紡織品的試紡成功。 在非洲大陸上，埃及彩棉獨放異彩。埃及彩棉的育種和栽培始于二十世紀七十年代中期，據(jù)悉，現(xiàn)已培育出淺紅色、淺綠色、淺黃色、淺灰色等彩棉品種。其特點是植株高大，株型松散，棉鈴大，纖維 長，強度高，品質好。但存在的主要問題是遺傳性狀不穩(wěn)定，彩棉色澤不達標。目前，埃及還沒有推出穩(wěn)定的彩棉品種，然而在國際棉花市場上保持著很高的聲譽。 秘魯在 5000 年前就有棕色棉紡織品，漁民還用來編織魚網(wǎng)。但后來由于引種和生產白色棉花，停止了彩色棉的種植。如今 , 秘魯彩色棉舊貌換新顏，秘魯科學文化藝術協(xié)會（ 立了天然彩色棉研究課題，已經培育出了米色、棕黃色、棕色、紅棕色、赭棕色和紫紅色等 5 種彩棉品種。1992 年，秘魯生產和紡織了約 300 噸有機彩色棉，并銷往美國、歐洲、日本等地。 印度是彩棉生產和研究 的后起之國。彩色棉研究始于 1990 年，在印度中央棉花研究所（ 有關的地區(qū)試驗站和農業(yè)大學進行。 1996 年，印度農業(yè)研究委員會（ 準了彩色棉專項基金，研究彩色棉纖維的遺傳規(guī)律，選育高產、優(yōu)質的彩色棉品種和雜交種，采用系選法育成 二倍體亞洲棉品種。 另外，巴基斯坦、澳大利亞等國的彩棉業(yè)也具有巨大的發(fā)展?jié)摿Α０突固谷珖鴵碛忻藁ㄆ贩N資源 1700多份，包括了棕、黃、綠、紫等眾多彩棉品種。澳大利亞勃羅依拉棉花研究中心 現(xiàn)保存著豐富的 彩色棉種質材料 ， 1994年，天然棕色和綠色棉織成的服裝正式亮相市場，織品以天然棕色或綠色與白色棉混紡而成，無任何化學染色劑，被稱為 “有機棉織品 ”或 “無公害織品 ”。 彩色棉的傳統(tǒng)遺傳學研究 在上世紀二十年代，中國的馮肇傳（ 1926）、馮澤芳、孫逢吉（ 1928） 就 研究 了 亞洲棉有色纖維的 遺傳， 并 指出棕色是顯性，白色是隱性，為一對簡單性狀遺傳。 六、七十年代，國內外已經有許多關于棉花棕褐色纖維和植株花青色素顏色的遺傳研究，其中大多數(shù)認為這些性狀受單基因控制，并以不完全顯性方式遺傳。前蘇聯(lián)學 者 等用棕褐色纖維品系 和白色纖維品系 7 雜交， 乳油色，即中間色； 離出 3 種顏色纖維：棕褐色、乳油色和白色，其比例接近 1 2 1，但它們之間并沒有明顯的界限，因此修飾基因對棕色基因有效應作用，另外，光照條件對纖維顏色也起作用。 等還研究了植株花青素顏色的遺傳，他們用植株表面為深花青色的 和普通綠色的 7 雜交， 中間色， 離出 3 種顏色的植株：深花青色、中間色和綠色，其比例接近 1 2 1。 前蘇聯(lián)學者 報道了白色纖維棉花品種與褐 色纖維的墨西哥半野生棉品種雜交群體纖維色澤的分析。他的研究表明，棉花纖維色澤受 3 對等位基因（ 制， 2 個主要的互補基因，缺乏其中任 1 個顯性等位基因，纖維色澤為白色； 3 個基因均為顯性純合狀態(tài)或只有 雜合狀態(tài)時，纖維色澤為棕褐色；當缺乏顯性等位基因而具備 顯性等位基因時，纖維色澤為淺乳黃色；其余基因型均表現(xiàn)為乳黃色纖維的性狀。特定的基因型與所對應的表型如表 示。 中國農業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 引言 3 表 墨西哥半野生棉品種基因 型與表型 of 因型 表型 褐色 黃色 乳黃色 色 上世紀七、八十年代，美國學者 用傳統(tǒng)的遺傳學方法，對綠色棉和棕色棉進行了更為深入的研究。他在 1985 年 報道，對綠色纖維、綠色短絨品系 白色纖維、綠色短絨品系 研究表明，這 3 個品系控制綠色纖維或綠色短絨的基因，位于 D 基因組 15 號染色體的 點，在此位點上，控制綠色纖維、綠色短絨的基因被命名為 制白色纖維、綠色短絨的基因被命名為 在同一篇文章中， 對不同的棕色棉品系進行了研究，他深化了前人的研究成果指出，控制棕色纖維基因的位點涉及 7 個： 中， 于 1957 年將 別定位于 6號染色體和 號染色體上。 這 4 個品系中，控制深棕色纖維的基因位于 點上；在品系 制棕色纖維的基因被命名為 時還存在一個附加的控制淺棕色纖維的基因，被命名為 和 4 個品系中，控制淺棕色纖維的基因位于 6 號染色體的 點上；品系 控制淺棕色纖維的基因分別被命名為 在我國，九十年代末掀起了一個研究彩色棉的小 高潮。張雪林（ 1997）對培育出來的彩棉品系綠89、綠 104 和棕 20 進行了深入的研究，推斷棕絨是由一對顯性基因控制的，而綠絨則可能是由眾多基因控制的。耿軍義等（ 1998）對若干彩棉品種研究后指出，陸地棉棕色或綠色纖維性狀受單基因控制，并表現(xiàn)為不完全顯性。朱乾浩等（ 1998）的研究也表明，棕色纖維性狀呈單基因不完全顯性遺傳。王留明等（ 1999）的研究結果顯示，棕色棉 8890 的棕色纖維性狀受單基因控制；然而，他們用白色棉徐 203 與綠色棉 8891 做正反交，又用徐 203 與綠色棉 8892（做父本）做雜交，在 3 個組合的 ，綠色植株與白色植株均不符合 3 1 比例，于是他們推測，品種徐 203 可能存在著對 因表達起抑制作用的隱性突變基因，并與 因獨立遺傳，只有在該基因呈顯性狀態(tài)時， 因才能表達。周雁聲（ 2000）用白色棉與棕色棉雜交，無論正反交 纖維均為淺棕色， 離為棕色、淺棕色與白色，且符合 1 2 1 的比例，進一步說明棕色纖維性狀由一對不完全顯性的單基因控制。張秉賢（ 2000）對彩色棉研究后認為，纖維色澤主要受一對基因控制，尤其是棕色棉表現(xiàn)得更為明顯；綠色棉的 中，有一部分植株表現(xiàn)為白色纖維、綠色短 絨，說明在一對主基因的控制下，還存在著一些微效基因。石玉真等（ 2001）研究認為，棕色纖維由一對主效基因控制，表現(xiàn)為不完全顯性遺傳，棕色纖維相對白色為顯性，同時，棕色纖維顯性性狀的表現(xiàn)還受控制短絨色澤的隱性基因的抑制。 中國農業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 引言 4 迄今為止，人們通過對舊世界棉和新世界棉的遺傳學研究，已經將彩色棉纖維色澤基因定位于特定的連鎖群和染色體上，如表 示。 表 纖維色澤基因及對應連鎖群和染色體 制的性狀 基因符號 所在連鎖群 所在染色體 深棕色纖維 7 淺棕色纖維 6 - 白色纖維 16 綠色纖維 彩色棉的生物化學和分子生物學研究 彩色棉的指紋圖譜研究 生物指紋圖譜是能夠鑒別生物個體之間差異的電泳圖譜，它具有多態(tài)性豐富，快速準確等優(yōu)點，是鑒別品種、品系（含雜交親本、自交系）的有力工具。目前， 子標記技術正迅速興起，它是繼形態(tài)學標記（ 細胞學標記（ 生化標記（ 后發(fā)展起來的一種新型遺傳標記，已經被廣泛應用于品種指紋圖譜的構建和品種親緣關系研究等領域。幾種典型的分子標記有 。 制性片斷長度多態(tài)性 ) 于 1974 年，是較早應用于基因標記的一項分子技術。由于不同基因型之中內切酶位點的堿基插入、 缺失、重組或突變，當利用限制內切酶消化基因組 ，會產生大小不同的 段，電泳后通過 跡雜交，將這些大小不同的 段轉移到硝酸纖維膜或尼龍膜上，然后用特異的探針進行雜交，最后通過放射性自顯影或其他顯色技術顯示雜交結果，從而揭示出 優(yōu)點是：無表型效應，其檢測不受環(huán)境條件和發(fā)育階段影響；共顯性，可以區(qū)別純合基因型和雜合基因型；可利用的探針很多，可以檢測到很多遺傳位點。缺點是：對 量要求高，需要量大，操作復雜，并且通常要接觸放射性。 機擴增多態(tài)性 ) 于 1990 年建立的通常以 10 堿基的寡核昔酸序列為引物，對基因組 機擴增，從而得到多態(tài)性圖譜作為遺傳標記的方法。與 比，它對 量要求不高，需要量極少，操作簡單易行，不需要接觸放射性。但不足之處是，絕大部分 顯性標記，不能區(qū)分基因型是純合的還是雜合的，每個標記提供的信息量少，再者重復性差。 增片斷長度 多態(tài)性 ) 統(tǒng)由 明，并已獲歐洲專利局的發(fā)明專利。 基于 應的一種選擇性擴增限制性片段的方法，其原理為基因組 限制內切酶消化，然后連上一個接頭(利用兩個選擇性引物進行 增。它既有 可靠性，也有 靈敏性。在中國農業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 引言 5 遺傳上 記為顯性或共顯性。它的最大優(yōu)點是多態(tài)性豐富，重復性好，能用于構建高清晰度的遺傳圖譜。缺點是需要用同位素來檢測，相對比較費時耗財。 單序列重復 ) 由幾個核苷酸 (2 5 個 )為重復單位組成的長達幾十個核苷酸的重復序列，廣泛分布于整個基因組上，由于重復次數(shù)的不同及重復程度的不完全造成了每個位點多態(tài)性。擴增出的 以檢測出復等位基因的差異，常表現(xiàn)為共顯性。 記是品種間系譜分析、指紋圖譜構建和分子標記輔助選擇育種等領域的有用工具，是應用較為廣泛的遺傳標記。但 析的缺點是必須針對