提到遺傳，我們都已經(jīng)習(xí)慣于這樣的概念，即基因組的編碼信息存在于ACGT這四種堿基的排列順序中。然而，諸如胞嘧啶的甲基化修飾及其分布，組蛋白的乙?；?，同樣影響著表型。這就構(gòu)成了表觀遺傳學(xué)(epigenetics)的主要研究內(nèi)容。其實，早在1942年，C.H.Waddinton就提出了表觀遺傳學(xué)的概念，他指出，表觀遺傳與遺傳相對，主要研究基因型和表型的關(guān)系。而現(xiàn)在，對于表觀遺傳學(xué)，比較統(tǒng)一的認識是，其研究在沒有細胞核DNA序列改變的情況時，基因功能的可逆的可遺傳的改變。也就是說，在不改變基因組序列的前提下，通過DNA和組蛋白的修飾等來調(diào)控基因表達，其中又以DNA甲基化(DNAmethylation)最為常見，成為表觀遺傳學(xué)的重要組成部分。隨著人類基因組計劃的開展，科學(xué)家們開始在基因組水平來研究表觀遺傳學(xué)，逐步形成表觀基因組學(xué)(epigenomics)。表觀基因組學(xué)就是要在整個基因組水平來研究表觀遺傳過程以及與這些過程密切相關(guān)的特定基因組區(qū)域的識別與鑒定。 2000年10月，人類表觀基因組協(xié)會(HumanEpigenomeConsortium)由歐盟贊助，啟動了旨在于人類6號染色體MHC區(qū)域首先做出DNA的甲基化圖譜的先導(dǎo)計劃(PilotProject)。該計劃順利完成，引導(dǎo)啟動了2003年的人類表觀基因組計劃(HumanEpigenomeProject，HEP)。2005年，美國國家衛(wèi)生院(NIH)下屬的國立癌癥研究所啟動了癌癥基因組先導(dǎo)計劃。2006年，該所與國立人類基因組研究所一起共同啟動癌癥基因組計劃(CancerGenomeProject)。表觀基因組學(xué)和DNA甲基化與癌癥的研究成為新的熱點。本文將簡要介紹DNA甲基化與CpG島，癌癥與DNA甲基化，和DNA甲基化的重要檢測方法。DNA甲基化與CpG島： 在人類表觀遺傳學(xué)研究中，最常見的就是CpG二核苷酸中胞嘧啶的甲基化修飾。其主要過程是，在CpG甲基化結(jié)合蛋白(Methyl-CpGBindingProteins,MBDs)和DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶(DNAmethyltransferases,DNMTs)的作用下，使CpG二核苷酸5’端的胞嘧啶轉(zhuǎn)變成為5’甲基胞嘧啶。在正常人類的DNA中，約有3-6%的胞嘧啶被甲基化。在哺乳動物中，約有50,000,000個CpG二核苷酸，其中70%的被甲基化。而那些可被甲基化的CpG二核苷酸并非隨機的分布于基因組序列中，相反，在基因組的某些區(qū)域中，通常是基因的啟動子區(qū)域，5’端非翻譯區(qū)和第一個外顯子區(qū)，CpG序列密度非常高，超過均值5倍以上，成為鳥嘌吟和胞嘧啶的富集區(qū)，稱之為CpG島(CpGIslands,CGIs)。 CpG島的概念最早由AdrianBird提出，他稱之為未甲基化的HapII小片段(HpaIITinyFragment，HTF)，更正式的定義是這樣的區(qū)域，該區(qū)域的序列長度至少200個堿基對，GC含量超過50%，CpG比值(觀測值/期望值)超過0.6。CpG比值的計算方法如下：.該區(qū)域的CpG二核昔酸數(shù)(#CpG) kb苴制r x該區(qū)域的堿基數(shù)()該區(qū)域的胞WC的數(shù)§(i±C)?烏嗟吟G的數(shù)目CG)最近，為了排除那些Alu重復(fù)序列，提出了更嚴格的標準：長度至少500堿基對，GC含量超過55%，CpG比值大于0.65。 據(jù)估計，哺乳動物基因組中的CpG島約有4萬個。在健康人的基因組中，CpG島中的CpG位點一般處于非甲基化狀態(tài)，而CpG島外的CpG位點通常是被甲基化的。研究表明，DNA的甲基化在遺傳印記(geneticimprinting)，胚胎發(fā)育以及維持正常細胞功能等方面發(fā)揮著重要作用。DNA甲基化與腫瘤發(fā)生： DNA甲基化水平和模式的改變是腫瘤發(fā)生的一個重要因素。這些變化包括CpG島局部的高甲基化和基因組DNA低甲基化狀態(tài)。如圖1左所示，在正常細胞中，位于抑癌基因啟動子區(qū)域的CpG島處于低水平或未甲基化狀態(tài)，此時抑癌基因處于正常的開放狀態(tài)，抑癌基因不斷表達抑制腫瘤的發(fā)生。而在腫瘤細胞中，該區(qū)域的CpG島被高度甲基化，染色質(zhì)構(gòu)象發(fā)生改變，抑癌基因的表達被關(guān)閉，從而導(dǎo)致細胞進入細胞周期，凋亡喪失，DNA修復(fù)缺陷，血管生成以及細胞粘附功能缺失等，最終導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。同樣，如圖1右所示，對于在正常細胞中處于高度甲基化的一些基因和重復(fù)序列，如果其甲基化水平降低，這些基因?qū)⒈磉_和重復(fù)序列將激活，從而導(dǎo)致基因印記丟失，細胞過度增長，不合適的細胞特異性表達，基因組脆性增加，以及內(nèi)寄生序列(endoparasiticsequence)的激活，最終也導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。正常摑跑II ?__, ?? T|1:|fiMiIITr,__||響叫苣H—FE2THE3}1— ——―?抑癌基因啟動子區(qū)域的CpG島 ?基因化的S'-調(diào)控區(qū)域 ?重復(fù)?染色質(zhì)構(gòu)象發(fā)生改變『處于正常的開放狀態(tài) eg.神系特異舟基因 鉤一轉(zhuǎn)座元件腫瘤細胞?CpG島高度甲基化 ?DNA高度甲基化 J1?染色質(zhì)處于關(guān)閉狀態(tài) ?染色底處于’開放’或*松散狀恣'未凈基化的CpG f申基化的CpG圖1.腫瘤生成中的DNA甲基化改變模式(取自EstellerM，NatRevGenet2007,8(4):286-298) 由于CpG島的局部高度甲基化要早于細胞惡性增生，故其甲基化的檢測可用于腫瘤的預(yù)測，而全基因組水平的低水平甲基化狀態(tài)，則隨著腫瘤惡性程度的增加而進一步降低，使其可用于腫瘤的診斷以及分級。近年來，不斷有研究顯示人類腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與DNA甲基化的異常有關(guān)，而且早在腫瘤臨床確診之前就可檢測出特異基因的甲基化異?，F(xiàn)象。所以甲基化可以作為腫瘤等早期診斷的生物標記物和預(yù)后評估指標，對腫瘤的篩查和風(fēng)險評估、早期診斷、分期分型、預(yù)后判斷及治療監(jiān)測都具有重要的意義。DNA甲基化檢測方法： 隨著DNA甲基化研究的不斷深入，其檢測方法也層出不窮。這些方法針對不同研究目的，運用不同的處理方法，幾乎涵蓋了從基因到基因組各個層次水平的研究。據(jù)檢測樣本不同，可以分為DNA和mRNA?，F(xiàn)有方法，絕大部分都是取樣于細胞的DNA，根據(jù)研究水平，又將這些方法歸為3大類，即：基因組甲基化水平(MethylationContent)的分析，候選基因甲基化分析，和基因組層次的DNA甲基化模式(Methylationpattern)與甲基化譜(MethylationProfiling)分析。主要方法分述如下：A.基因組甲基化水平(MethylationContent)的分析：高效液相色譜(High-performanceLiquidChromatography,HPLC) HPLC是一種比較傳統(tǒng)的方法，是根據(jù)DNA或蛋白分子量和構(gòu)象的不同而使其加以分離。由于在動態(tài)相和靜態(tài)相下分子的光吸收度并不相同而加以定量。隨著系統(tǒng)的壓強的增加，其分辨率增高。故而能夠定量測定基因組整體水平DNA甲基化水平。該方法由Kuo等1980年首次報道。過程是將DNA樣品先經(jīng)鹽酸或氫氟酸水解成堿基，水解產(chǎn)物通過色譜柱，結(jié)果與標準品比較，用紫外光測定吸收峰值及其量，計算5mC/(5mC+5C)的積分面積就得到基因組整體的甲基化水平。這是一種檢測DNA甲基化水平的標準方法。高效毛細管電泳法(High-performanceCapillaryElectrophoresis,HPCE) 這是一種利用窄孔熔融石英毛細管來從復(fù)合物中分離不同化學(xué)組分的技術(shù)。其基礎(chǔ)是在強電場下不同分子的由于其所帶電荷，大小，結(jié)構(gòu)以及疏水性等不同而相互分開。用HPCE方法處理DNA水解產(chǎn)物來確定5mC水平，簡便，經(jīng)濟且敏感性高。在這兩種方法的基礎(chǔ)上，不斷有新方法改進，包括，變性高效液相色譜(DHPLC)，逆向高效液相色譜(ReversedphaseHPLC)以及HPLC與薄層色譜(Thin-layerChromatography,TLC)相結(jié)合的HPLC-TLC方法。除上述方法外，還有其他原理的檢測方法，如單純的TLC方法以及最佳近鄰TLC(NearestneighbourTLC)，基于抗5mC的免疫學(xué)技術(shù)(Anit-5mCimmunologicaltechniques),SssI甲基轉(zhuǎn)移酶法(SssImethylAcceptanceAssay)，在重亞硫酸鹽處理的基礎(chǔ)上而進行的氯乙醛反應(yīng)法(Chloacetaldehydereaction)和酶區(qū)甲基化分析(EnzymaticRegionalmethylationAssay,ERMA)。必須指出，以上各種方法雖然能夠明確檢測出目的序列中所有CpG位點的甲基化狀況，但并不能對甲基化位點進行定位。B.候選基因(CandidateGene)甲基化分析:甲基化敏感性限制性內(nèi)切酶-PCR/Southern法(methylation-sensitiverestrictionEndonuclease-PCR/Southern,MSRE-PCR/Southern) 這種方法利用甲基化敏感性限制性內(nèi)切酶對甲基化區(qū)的不切割的特性，將DNA消化為不同大小的片段后，進行Southern或PCR擴增分離產(chǎn)物，明確甲基化狀態(tài)再進行分析。常使用的甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶有Hpall-MspI(CCGG)和Smal-Xmal(CCCGGG)等。重亞硫酸鹽測序法(BisulphiteSequencing) 該方法首先用重亞硫酸鹽使DNA中未發(fā)生甲基化的胞嘧啶脫氨基轉(zhuǎn)變成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不變，行PCR擴增所需片段，則尿嘧啶全部轉(zhuǎn)化成胸腺嘧啶，最后，對PCR產(chǎn)物進行測序并且與未經(jīng)處理的序列比較，判斷是否CpG位點發(fā)生甲基化。此方法是精確度很高，能明確目的片段中每一個CpG位點的甲基化狀態(tài)，但需要大量的克隆測序，過程較為繁瑣、昂貴。甲基化特異性的PCR(methylation-specificPCR,MS-PCR) 該方法同樣DNA先用重亞硫酸鹽處理，隨后行引物特異性的PCR。其設(shè)計兩對引物，分別與重亞硫酸鹽處理后的序列互補配對，即一對結(jié)合處理后的甲基化DNA鏈，另一對結(jié)合處理后的非甲基化DNA鏈。檢測MS-PCR擴增產(chǎn)物，如果用針對處理后甲基化DNA鏈的引物能擴增出片段，則說明該被檢測的位點存在甲基化；反之亦然。甲基化熒光法(MethyLight) 結(jié)合重亞硫酸鹽處理待測DNA片段，設(shè)計一個能與待測位點區(qū)互補的探針，探針的5’端連接報告熒光，3’端連接淬滅熒光，隨后行實時定量PCR。如果探針能夠與DNA雜交，則在PCR用引物延伸時，TaqDNA聚合酶5'到3'端的外切酶活性會將探針序列上5'端的報告熒光切下，淬滅熒光不再能對報告熒光進行抑制，這樣報告熒光發(fā)光，測定每個循環(huán)報告熒光的強度即可得到該位點的甲基化情況及水平。本方法高效，迅速，具備可重復(fù)、所需樣本量少、不需要電泳分離的特點。焦磷酸測序(Pyrosequencing) 該方法，由4種酶催化同一反應(yīng)體系中的酶級聯(lián)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，在每一輪測序反應(yīng)中，只加入一種dNTP，若該dNTP與模板配對，聚合酶就能將其加入到引物鏈中并釋放出等摩爾數(shù)的焦磷酸(PPi)°PPi可最終轉(zhuǎn)化為可見光信號，并由PyrogramTM轉(zhuǎn)化為一個峰值，其高度與核苷酸數(shù)目成正比。當用于甲基化檢測時，經(jīng)重亞硫酸鹽處理的序列可以看作是C-T型的SNP改變。其操作簡單，結(jié)果準確可靠，可以行大規(guī)模分析。結(jié)合重亞硫酸鹽的限制性內(nèi)切酶法(combinedbisulfiterestrictionanalysis,COBRA) 這種方法對標本DNA行重亞硫酸鹽處理及PCR擴增，處理后原甲基化的胞嘧啶被保留，而非甲基化的胞嘧啶變?yōu)樾叵汆奏ぁｋS后用限制性內(nèi)切酶對轉(zhuǎn)化后PCR產(chǎn)物切割的特性以識別原標本DNA的甲基化狀況。該方法相對簡單，不需預(yù)先知道CpG位點及樣本序列。C.基因組范圍的DNA甲基化模式(Methylationpattern)與甲基化譜(MethylationProfiling)分析：限制性標記基因組掃描(RestrictionLandmarkGenomicScanning,RLGS) RLGS是最早適用于基因組范圍DNA甲基化分析的方法之一。該方法先用甲基化敏感的稀頻限制性內(nèi)切酶NotI消化基因組DNA，甲基化位點保留，標記末端、切割、行一維電泳，隨后再用更高頻的甲基化不敏感的內(nèi)切酶切割，行二維電泳，這樣甲基化的部分被切割開并在電泳時顯帶，得到RLGS圖譜與正常對照得出缺失條帶即為甲基化的可能部位。甲基化間區(qū)位點擴增(amplificationofinter-methylatedsites,AIMS) AIMS是基于任意引物PCR(ArbitraryPrimedPCR)的一種方法，由于任意引物PCR使用寡核苷酸連接子(linker)進行連接，不需要依賴任何序列的先驗信息。在該方法中，用來進行擴增的模板序列首先通過甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶進行消化而富集，其特異性由該酶酶切片斷一端的特定序列結(jié)合連接子來保證。隨后，由內(nèi)切酶進行第二次消化，再次連接，提純進行PCR擴增，最后電泳，提取目的序列進行測序。甲基化CpG島擴增(MethylatedCpG-islandamplification,MCA) MCA也是基于任意引物PCR的方法，該方法使用兩種對甲基化具有不同敏感度的限制性內(nèi)切酶(如SmaI和XmaI)先后進行消化，然后對甲基化敏感的限制性酶切片斷進行接頭(Adaptor)連接，行PCR，那些富含CpG的序列就會被選擇性的擴增。該方法對甲基化分析和克隆甲基化差異性基因都非常有幫助。差異甲基化雜交(DifferentialMethylationHybridization,DMH) DMH屬于一種芯片技術(shù)，在該技術(shù)中，包括擴增子(Amplicon)生成和CGI文庫篩選兩個重要組成部分。在擴增子生成中，首先用MseI來酶切DNA樣本，然后接上連接子，并去除重復(fù)序列，這時的樣本一分為二，其一直接進行PCR擴增，生成僅由MseI處理過的擴增子，而另一半則用甲基化敏感的酶BstUI進行消化，然后進行PCR擴增，生成由MseI/BstUI共同處理過的擴增子。CGI文庫通過篩查出重復(fù)序列，然后進行PCR，選出含有BstUI位點的克隆，最后這些克隆一式兩份點到芯片上，制備成CGI芯片。然后把兩種不同的擴增子分別雜交到相應(yīng)的CGI克隆點上，最后通過差異性對比檢測出那些未甲基化位點。由連接子介導(dǎo)PCR出的HpaII小片斷富集分析(HpaIItinyfragementEnrichmentbyLigation-mediatedPCR,HELP) 該方法用HpaII與其對甲基化敏感同裂酶MspI對同一基因組序列進行消化，產(chǎn)生不同的代表性序列，然后對此序列進行連接子介導(dǎo)的PCR，瑞和進行電泳等比較分析或?qū)⒋薉NA樣本共雜交到基因組芯片上進行分析。這種方法已經(jīng)揭示了大量的組織特異性，差異甲基化區(qū)域，并用于正常細胞和癌癥細胞的基因組比較分析。甲基化DNA免疫沉淀法(MethylatedDNAimmunoprecipitation,MeDIP) 這是一種高效富集甲基化DNA的方法。在該方法中，可與5mC特異性結(jié)合的抗體加入到變性的基因組DNA片段中，從而使甲基化的基因組片斷免疫沉淀，形成富集。通過與已有DNA微芯片技術(shù)相結(jié)合，從而進行大規(guī)模DNA甲基化分析。該方法簡便，特異性高，適合DNA甲基化組學(xué)(DNAMethylome)的分析。 通過以上論述，不難看到檢測甲基化的方法不斷涌現(xiàn)，一方面說明其研究難度之大，另一方面也說明種種方法都有其局限性，諸如對酶的依賴，PCR擴增的問題，芯片數(shù)據(jù)分析的標準化問題等等。綜上所述，各種表觀基因組學(xué)技術(shù)方法使我們可以繪制出諸如DNA甲基化以及組蛋白修飾模式的詳細圖譜，為我們研究甲基化的生物學(xué)功能，以及在腫瘤生成中的作用，以致腫瘤預(yù)防，診斷，治療和預(yù)后方面提供更多信息。然而，為了實現(xiàn)這個宏遠目標，需要的不僅僅是支助的增加，還有國際同行的密切合作。參考文獻： 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