1、免疫組化,牛君星,實(shí)驗(yàn)內(nèi)容,免疫組化（IHC） 免疫熒光（IF） tunel,免疫組化簡介,免疫組化，是應(yīng)用免疫學(xué)基本原理抗原抗體反應(yīng)，即抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑（熒光素、酶、金屬離子、同位素）顯色來確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原（多肽和蛋白質(zhì)），對(duì)其進(jìn)行定位、定性及定量的研究，稱為免疫組織化學(xué)技術(shù)(immunohistochemistry)或免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)(immunocytochemistry)。,實(shí)驗(yàn)標(biāo)本及抗體,實(shí)驗(yàn)所用主要為組織標(biāo)本和細(xì)胞標(biāo)本兩大類，前者包括石蠟切片和冰凍切片，后者包括細(xì)胞爬片和細(xì)胞涂片。 實(shí)驗(yàn)中常用的抗體為單克隆抗體和多克隆抗體，單克隆抗體是一

2、個(gè)B淋巴細(xì)胞克隆分泌的抗體，應(yīng)用細(xì)胞融合雜交瘤技術(shù)免疫動(dòng)物制備。多克隆抗體是把純化后的抗原直接免疫動(dòng)物后，從動(dòng)物血中所獲得的免疫血清，是多個(gè)B淋巴細(xì)胞克隆所產(chǎn)生的抗體混合物。,免疫組化原理,免疫組化實(shí)驗(yàn)步驟,石蠟切片脫蠟至水 抗原修復(fù)后自然冷卻 3%雙氧水封閉內(nèi)源性過氧化物酶,然后PBS洗（熒光可省略此步） 組化筆畫圈防止液體流走 BSA或者血清封閉 加一抗4過夜,PBS洗 加酶標(biāo)或者熒光素標(biāo)記二抗，然后PBS洗,DAB顯色（熒光不用顯色） 蘇木精或者DAPI染細(xì)胞核 組化酒精脫水二甲苯透明封片，熒光抗熒光淬滅封片劑封片 顯微鏡觀察,免疫組化結(jié)果的判斷和分析,非特異染色是指免疫組化染色過程中產(chǎn)

3、生的非靶抗原的呈色結(jié)果，屬假陽性，又稱背景著色，能嚴(yán)重干擾免疫組化染色結(jié)果的正確判斷，應(yīng)竭力避免或者減輕。其原因涉及免疫組化染色流程的各個(gè)環(huán)節(jié)，可來自：1.組織內(nèi)源性干擾素（自發(fā)熒光，內(nèi)源酶）2.抗體及試劑（抗體不純，試劑污染）3.組織處理不當(dāng)（組織固定不及時(shí)或者固定不良所導(dǎo)致的抗原彌散移位）4.操作過程（修復(fù)過度、洗滌不充分導(dǎo)致的游離試劑殘留或者操作過程干片）,免疫組化結(jié)果的判斷和分析,實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陰性可能的原因： 1.標(biāo)本固定不當(dāng)或者切片時(shí)間過長抗原丟失或者組織本身抗原含量過低 2.一抗失效或者稀釋度過高或者所選一抗不適合標(biāo)本種屬 3.操作失誤：漏加一抗或者二抗選擇錯(cuò)誤 4.修復(fù)強(qiáng)度不夠，抗

4、原暴露不充分,大鼠心臟，背景深，無特異陽性,腫瘤：背景深,腦背景深，無特異陽性,肝臟：非特異性染色,腫瘤：結(jié)果為陰性,胰腺：結(jié)果為陰性,小鼠肝，幾乎陰性,小鼠腫瘤，幾乎陰性,肺冰切，PCNA無表達(dá)，片子很皺,膜陽性：E-cad,膜陽性：-catenin,核陽性：ki67,核陽性：HMGB1,胞漿陽性：小鼠睪丸BAX,胞漿陽性：小鼠腫瘤MPO,血管類表達(dá)：VWF,血管類表達(dá)：CD31,血管類表達(dá)：CD34,血管類表達(dá)：VEGF,神經(jīng)類表達(dá)：Neun,神經(jīng)類表達(dá)：GFAP,神經(jīng)類表達(dá):IBA-1,神經(jīng)類表達(dá)：TH,神經(jīng)類表達(dá)：MBP,巨噬細(xì)胞：CD68,巨噬細(xì)胞：MAP-2,細(xì)胞骨架：-tublin,細(xì)胞骨架：-SMA,細(xì)胞骨架：vimentin,細(xì)胞骨架：F-actin,tunel,注意事項(xiàng),銷售同事在接單子的時(shí)候要寫清楚標(biāo)本種屬（大鼠、小鼠、人），標(biāo)本類別（心肝脾肺腎）以及指標(biāo)、抗體貨號(hào)，特殊