1、首先細(xì)胞數(shù)一定要夠， 接觸抑制后，加誘導(dǎo)液，誘導(dǎo)液一（IBMX是SIGMA的，濃度我用0.5m mol/l,配的時(shí)候用 DMSO濃縮1000倍，DEX我用的是 Solarbio分裝的100MG的也用 DMSO 溶，Ins我用的人用胰島素，醫(yī)院買(mǎi) 的），最主要的是要細(xì)胞代數(shù) 20代以內(nèi)，換誘導(dǎo)液2 時(shí)不用1ML的移液槍加用200ul的慢慢加.讓細(xì)胞長(zhǎng)滿以后，接觸抑制2天（是細(xì)胞退出生長(zhǎng)周期），加入含有 舊MX （一般使用濃度0.5mmol/L）, DEX （地塞米松，一般使用濃度是1umol/L）和insulin （胰島素，一般使用濃度1-10ug/ml ）的培基2天，再換成只含胰島素的培基 2

2、天，然后每?jī)商鞊Q液（普通培基）。 這 是分化的步驟，但是最關(guān)鍵的是細(xì)胞的傳代次數(shù)，我現(xiàn)在就在做誘導(dǎo)，細(xì)胞傳代次數(shù)較 多，分化率很低。一般說(shuō)不能超過(guò)20代，最好在10代以內(nèi)。誘導(dǎo)分化中，細(xì)胞的傳代數(shù)和狀態(tài)是最重要的。誘導(dǎo)劑的配制舊MX（異丁基-甲基-黃喋吟）：分子量：222.2 （Sigma:I587吩-20度保存用二甲基亞碉 DMSO配制111.1mg/ml （0.5mol/L）儲(chǔ)存液終濃度為0.5mmol/L,即每100ml培養(yǎng)液加100ul儲(chǔ)存液。DEX分子量：392.5 （Sigma:D4902）-20度保存用無(wú)水乙醇配制1mg/ml（2.5mmol/L）儲(chǔ)存液終濃度為1umol/L,即

3、每100ml培養(yǎng)液加40ul儲(chǔ)存液。可用2年。Insulin：分子量：6000 ,4度保存原液為諾和靈 R: 400IU/10ml終濃度為10ug/ml,即每100ml培養(yǎng)液加600ul原液。4度保存3T3-L1前脂肪細(xì)胞株的誘導(dǎo)分化1）將3T3-L1前脂肪細(xì)胞接種于培養(yǎng)板，用含 10%小牛血清的高糖DMEM培 液在37C、5%CO2培養(yǎng)；2）待細(xì)胞長(zhǎng)滿至80-90%,融合2天（融合的意思是指讓細(xì)胞接觸抑制，就是 長(zhǎng)滿后換液讓其再長(zhǎng)兩天）后，加含終濃度為 0.5mmol/L IBMX （儲(chǔ)存液濃 度 0.5mmol/L）、終濃度為 1umol/L（儲(chǔ)存液濃度為 1mg/ml（2.5mmol/L

4、）DEX 和終濃度為10ug/ml的胰島素的10%小牛血清高糖DMEM培養(yǎng)48h;（誘導(dǎo) 劑臨用時(shí)再加到培液中混勻）3） 48h后換含終濃度為10ug/ml的胰島素的10%小牛血清高糖DMEM培養(yǎng)液 再培養(yǎng)48h, 48h后再換10%小牛血清高糖DMEM繼續(xù)培養(yǎng)，2天后換培 養(yǎng)液一次，誘導(dǎo)分化812天3T3-L1細(xì)胞90%多呈成熟脂肪細(xì)胞表型，可 用于實(shí)驗(yàn)。誘導(dǎo)操作注意事項(xiàng)：1、一共需誘導(dǎo)3次，每次誘導(dǎo)的時(shí)間點(diǎn)最好固定，保證誘導(dǎo)劑作用夠 48h,若 時(shí)間沖突誘導(dǎo)的時(shí)間只可延長(zhǎng)，不可短于 48h。2、誘導(dǎo)操作需注意：以6孔板為例，每孔3ml培液，一個(gè)6孔板需18ml培液， 則第一次誘導(dǎo)時(shí)誘導(dǎo)劑的

5、劑量分別是：IBMX18U1 （儲(chǔ)存液），DEX7.2ul儲(chǔ)存液， 胰島素108ul （儲(chǔ)存液）。第一遍誘導(dǎo)時(shí)用200ul的移液槍先每孔加200ul配制 好的誘導(dǎo)液，沿孔壁邊緣來(lái)回橫著劃慢慢注下培液，動(dòng)作一定要慢，不然細(xì) 胞會(huì)飄起來(lái)，俗稱卷邊。每孔加5遍200ul培液，合計(jì)1ml,第二、三遍則每 孔1000U1加培液，方法同上，操作要慢、輕。3、第2次誘導(dǎo)時(shí)，誘導(dǎo)劑的配制為：18ml培液，加胰島素108ul （儲(chǔ)存液），混 勻，操作步驟同前。第一次和第二次誘導(dǎo)很重要，動(dòng)作一定要慢。第 3次誘 導(dǎo)誘導(dǎo)僅需換10%高糖DMEM培液，但操作步驟同前，一般結(jié)果好的話第三 次誘導(dǎo)之前細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)少量小脂滴

6、，培液變黃，因?yàn)榧?xì)胞里有脂滴了所以培 液看起來(lái)就黃了。4、第三次誘導(dǎo)以后，可見(jiàn)細(xì)胞內(nèi)脂滴變大，但此時(shí)仍有細(xì)胞內(nèi)的脂滴剛誘導(dǎo)出 來(lái)，需要兩天后再次換液，此時(shí)換液則可每次 1ml的培液換，一般換液2天 后幾乎所有細(xì)胞內(nèi)均可見(jiàn)脂滴，且脂滴較大，可用于加藥處理。細(xì)胞是否誘導(dǎo)成功細(xì)胞代數(shù)很重要，我們這邊一般是13代以后的細(xì)胞就很難誘導(dǎo)出來(lái)了，代數(shù)越靠后，細(xì)胞狀態(tài)越不好，越容易卷邊。3T3-L1細(xì)胞的誘導(dǎo)分化，在前兩天的融合期的時(shí)候，確定你用的是DMEM高糖+小牛血清，在細(xì)胞高度融合以后才能開(kāi)始進(jìn)行第一階段的誘導(dǎo)（MDI誘 導(dǎo)，DMEM高糖+胎牛血清），第一階段后，細(xì)胞中可以觀察到細(xì)胞已經(jīng)開(kāi)始變圓，第二階

7、段的誘導(dǎo)（ insulin誘導(dǎo)，DMEM高糖+胎牛血清），細(xì)胞中 就可以觀察到脂肪滴，進(jìn)入第三個(gè)階段的誘導(dǎo)的時(shí)候，脂肪滴的聚集更加明顯。誘導(dǎo)劑如地塞米松是需要乙醇溶解的，舊MX是在一定濃度的 KOH溶解 的，insulin是在一定濃度的 HCL中溶解的，誘導(dǎo)分化的程度也和細(xì)胞有關(guān)，同為3T3-L1細(xì)胞，但是每種細(xì)胞的分化能力有很大的差異，在沒(méi)有進(jìn)入 分化誘導(dǎo)的時(shí)候，一定不能用胎牛血清來(lái)養(yǎng)細(xì)胞！在分化期有少量的細(xì)胞出現(xiàn)死亡是正常的！兩天進(jìn)行一次換液，因此一定要小心被污染！祝各位實(shí)驗(yàn)順利！共同學(xué)習(xí)!因?yàn)?T3-L1加入誘導(dǎo)劑以后，收縮得很厲害，比較脆弱，很容易就飄起來(lái)。所以加誘導(dǎo)劑的時(shí)候，手法要特

8、別輕，最好用槍頭加，不要用移液管，因?yàn)橐埔汗芗业臅r(shí)候很難控制流速，力度大。用槍頭加誘導(dǎo)劑的時(shí)候，一定要貼壁加，讓液體慢慢留下，這樣對(duì)細(xì)胞的沖擊 小。我正在做誘導(dǎo)分化，感覺(jué)細(xì)胞飄起來(lái)一小部分的話，還是能用，沒(méi)有什么大的影響，如果范圍比較大的話最好重新誘導(dǎo)。你的誘導(dǎo)劑的濃度與一般人用的濃度不太一樣。舊MX大家一般都是用 0.5mmol/L ,胰島素一般都是1-10ug/ml , dex有用0.25, 1, 10umol/L的。另外，不知道你買(mǎi)的胰島素是水溶性 的嗎？因?yàn)橐话?的胰島素是不溶于水的，但是在酸性環(huán)境中溶于水，所以配液時(shí)需要加一 點(diǎn)稀鹽酸使胰島素溶解。其他兩種誘導(dǎo)劑你的配液方法沒(méi)有問(wèn)題。

9、 鏡下觀察細(xì)胞接 觸抑制什么形態(tài)？這有什么可說(shuō)的嗎，不就是長(zhǎng)滿了嗎，互相接觸在一起 了，如果你的細(xì)胞出現(xiàn)疊叢現(xiàn)象了，那么就是接觸抑制過(guò)度了，那細(xì)胞就更容易飄起來(lái)了。這就需要你自己把握好時(shí)機(jī)，因?yàn)橐菇佑|抑制時(shí)間不夠的話，細(xì)胞沒(méi)有退出生長(zhǎng)周期，誘導(dǎo)劑就不會(huì)起作用；如果接觸抑制過(guò)度的話，細(xì)胞很容易就飄起來(lái)。你自 己需要自己摸索一定要在細(xì)胞狀態(tài)好的情況下誘導(dǎo)分化，3T3-L1長(zhǎng)得非?？欤绻L(zhǎng)滿以后不換液， 會(huì)有大批細(xì)胞死亡，判斷細(xì)胞好壞的標(biāo)準(zhǔn)是cell confluent后，培養(yǎng)基中很少有漂浮的死亡細(xì)胞。所以誘導(dǎo)前傳代的細(xì)胞在接種時(shí)數(shù)量不要太大，最好在10*4數(shù)量級(jí)，這樣讓細(xì)胞長(zhǎng)3天后鋪滿，再換液

10、，再讓細(xì)胞長(zhǎng)2-3天，這時(shí)的細(xì)胞會(huì)退出生長(zhǎng)周期，進(jìn)入 growth arrest狀態(tài)。2,舊MX的溶解方法有多種，不同文獻(xiàn)有不同方法，DMSO,乙醇，濃鹽酸，KOH溶液者B可，針對(duì)你所說(shuō)的出現(xiàn)結(jié)晶問(wèn)題建議你用1M KOH試試，即0.0115 gIBMX + 940 ul ddh H2O + 60 ulKOH, 3,胰島素濃度大一點(diǎn)只會(huì)促進(jìn)分化，不會(huì)有抑制作用，因?yàn)?Preadiopocyte細(xì)胞膜上胰島素 受體很少，所以需加超過(guò)生理濃度的insulin,以其激活細(xì)胞膜上的IGF1受體，通過(guò)IGF1通路來(lái)誘導(dǎo)分化。我用的方法是美國(guó)密歇根大學(xué)的3T3-L1細(xì)胞分化的PROTOCO郎常詳細(xì)，現(xiàn)發(fā)給各

11、位戰(zhàn)友共享，呵呵.如果不能成功分化的話，只能質(zhì)疑細(xì)胞的問(wèn)題了.3T3-L1 Differentiation ProtocolMATERIALSDulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM; GibcoBRL-Cat# 11965-084: high glucose, with L-glutamine, with pyroxidine HCl, without sodium pyruvate)Calf Serum (GibcoBRL-Cat#16170-078Lot #1060198)Fetal Bovine Serum (GibcoBRL-Cat# 1

12、0437-028/Lot # 1026566)-filter sterilize (0.22um filter) before mixed into DMEMIsobutylmethylxanthine (IBMX; Sigma I-7018)Dexamethasone (Sigma D-4902)Insulin (Bovine; Sigma I-5500)MEM Sodium Pyruvate (100mM; GibcoBRL Cat#11360-070)Pen/Strep/Glutamine (100x P/S/G; GibcoBRL Cat#10378-016)SOLUTIONS10%

13、Calf Serum/DMEM60mL Calf Serum6mL 100mM MEM Sodium Pyruvate6mL 100x P/S/G500mL DMEM10% FBS/DMEM60mL Fetal Bovine Serum (Filter Sterilized)6mL 100mM MEM Sodium Pyruvate6mL 100x P/S/G500mL DMEM舊MX Solution (make fresh)a)Dissolve IBMX in a solution made of 0.5N KOH to a final concentration of 0.0115g/m

14、L. b)Filter sterilize through a 0.22 mm syringe filter.Insulin Stock Solution167 uM (1mg/mL) in 0.02M HClFilter sterilized through 0.22 mm filterCan store at -20C for long term, 4C short term.Dexamethasone Stock SolutionsFreezer Stock: 10mM of Dex in 100% ethanol (store at -20C)Working Stock: Dilute

15、 Freezer stock to 1mM in PBSFilter sterilize and store at 4C.MDI Induction Media (10mL/10cm plate; 5mL/ 6cm plate)To required volume of 10% FBS/DMEM add:1:100 IBMX1:1000 Insulin1:1000 Dexamethasone working stockInsulin Media (10mL/10cm plate; 5mL/ 6cm plate)To required volume of 10% FBS/DMEM add:1:1

16、000 InsulinMETHODPreadipocyte maintenance and passage:We plate the cells in 10% CS/DMEM on treated polystyrene culture dishes from Corning (Cat#430167) and incubate them at 37C in 10% CO2. It is important to feed the preadipocytes every couple of days and avoid letting them get too confluent (>70

17、%), if you want to continue to passage them and differentiate them at a later date. So, take care to split them appropriately. They can be split as far as 1:15, though we usually do 1:10 or less depending on need.Adipocyte Differentiation Protocol:1. Grow preadipocytes to confluency in 10% calf serum/DMEM2. Two days post confluency (DAY 0) stimulate the cells with MDI induction media. You will notice a distinct change in the morphology of the cells (become more spindly) in the next 2 days.3. Two days after MDI (DAY 2) change the media to